咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA水平與社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎炎性反應(yīng)及免疫功能的關(guān)系

田增春，梁璐，劉陽，曾苑，薛海蓉

作者單位：南陽市中心醫(yī)院兒一科，河南 南陽 473000

社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎（community acquired-mycoplasma pneumoniae pneumonia，CA-MPP）為兒童多發(fā)性肺炎類型，主要由肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）侵襲病兒下呼吸道所致［1-2］。臨床研究指出，CA-MPP 的病情受MP 致病性、耐藥性及病兒免疫功能等因素影響［3］。此外，MP 可通過自身及代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)損傷人體組織，并引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)加重癥狀損傷［4］。但CA-MPP 病兒MP-DNA 與炎性、免疫反應(yīng)的關(guān)系仍缺乏循證依據(jù)。本研究嘗試分析咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平與CA-MPP 病兒炎性反應(yīng)、免疫功能的關(guān)系，旨在為臨床治療本病提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月至2019 年5 月南陽市中心醫(yī)院收治的CA-MPP 病兒92 例，其中女29例，男63 例；年齡范圍為6 個月至12 歲，年齡（3.15±1.32）歲；重癥病兒30例，輕癥病兒62例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

納入標準：（1）符合MPP 診斷標準［5］，且為急性期；（2）雙份血清抗體滴度升高4 倍及4 倍以上；（3）均為社區(qū)獲得性；（4）首發(fā)癥狀均為發(fā)熱、咳嗽；（5）年齡≤12 歲；（6）無混合其他感染；（7）均需行支氣管肺泡灌洗；（8）病兒近親屬知曉本研究，已簽署同意書。

排除標準：（1）肥胖或嚴重營養(yǎng)不良病兒；（2）有精神疾病病兒；（3）血液系統(tǒng)疾病、免疫性疾病病兒；（4）近3 周內(nèi)有感染性疾病史病兒；（5）心臟、腦等重要臟器嚴重病變病兒；（6）合并肺結(jié)核、哮喘等其他肺部疾病病兒。

CA-MPP 重癥：符合CA-MPP 診斷，同時符合以下標準中（1）、（2）、（3）以及（4）、（5）中任意一項的病兒。（1）有明顯的心動過速或氣促，可伴或不伴有發(fā)紺及三凹征等；（2）使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素＞1 周，但無效，或發(fā)熱持續(xù)10 d 以上；（3）胸片示占據(jù)一個肺段或肺葉以上范圍的大片陰影，可累及單葉或多葉病變；（4）伴有嚴重肺內(nèi)并發(fā)癥；（5）伴有嚴重低氧血癥或其他臟器功能的嚴重損害。輕癥：符合CA-MPP診斷，但不符合以上重癥診斷標準［5］。

1.2 方法

1.2.1 MP-DNA 水平檢測 （1）標本采集：入院2 h內(nèi)，采用咽拭子采集所有病兒咽后壁拭取物，無菌試管保存，置于放有冰塊的保溫箱里，2 h內(nèi)送檢；取病兒肺泡灌洗液5 mL，置于放有冰塊的保溫箱里，即刻送檢。（2）檢測方法：咽拭子標本加入0.9%氯化鈉溶液中，輕震蕩后低溫保存過夜，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理5 min 后取沉淀物，加入DNA 提取液50 μL，100 ℃條件下恒溫處理10 min 左右，以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心處理5 min 后取沉淀物備用。取肺泡灌洗液標本，以同樣方法提取DNA。取DNA標本，采用美國BIO-RADicycler 基因擴增儀進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，測定MP-DNA水平，試劑盒購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司。（3）分組方法：根據(jù)咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平將92 例CAMPP 病兒分為低菌量組（MP-DNA＜103copies/mL，22 例）、中菌量組（MP-DNA 103～106copies/mL，42例）、高菌量組（MP-DNA＞106copies/mL，28例）。

1.2.2 血清炎性反應(yīng)因子檢測 采集所有病兒入院當天靜脈血4 mL，以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心處理10 min后取血清，分成兩份，置于-80 ℃冷藏室內(nèi)待檢，采用放射免疫分析法測定血清白細胞介素-18（IL-18）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，以酶聯(lián)免疫分析法檢測血清C 反應(yīng)蛋白（CRP）水平，試劑盒購自北京方程生物科技有限公司。

1.2.3 免疫功能指標檢測 與血清炎性反應(yīng)因子同時檢測，取血清標本采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清免疫球蛋白A（IgA）、IgM、IgG水平，試劑盒購自北京方程生物科技有限公司。

1.3 觀察指標 （1）觀察不同病情程度病兒咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平。（2）觀察不同菌量組血清CRP、TNF-α、IL-18、IgA、IgM、IgG 水平。（3）分析MP-DNA表達量與炎性反應(yīng)、免疫功能的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 23.0 進行研究資料分析。觀察指標主要為計量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗，以±s描述。兩組比較為成組t檢驗或校正t檢驗。 多組比較為單因素方差分析+兩兩比較LSD-t檢驗。此外，相關(guān)分析為Pearson相關(guān)性分析。本研究統(tǒng)計推斷的檢驗水準均為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同病情程度病兒咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA 水平比較 重癥病兒咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA水平較輕癥病兒高（P＜0.05），見表1。

表1 社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎92例咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA（MP-DNA）水平比較/±s

表1 社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎92例咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA（MP-DNA）水平比較/±s

組別重癥組輕癥組t值P值例數(shù)30 62咽拭子MP-DNA 5.68±0.73 5.14±0.51 5.27＜0.001肺泡灌洗液MP-DNA 6.87±0.85 5.70±0.63 4.72＜0.001

2.2 不同菌量組炎性反應(yīng)因子水平比較 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 高菌量組血清CRP、TNF-α、IL-18水平較中菌量組、低菌量組高（P＜0.05），見表2。

表2 社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎92例不同菌量組炎性反應(yīng)因子水平比較/±s

表2 社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎92例不同菌量組炎性反應(yīng)因子水平比較/±s

注：CRP為C反應(yīng)蛋白，IL-18為白細胞介素-18，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與低菌量組比較，P＜0.05。②與中菌量組比較，P＜0.05。

組別咽拭子MP-DNA高菌量組中菌量組低菌量組F值P值肺泡灌洗液MP-DNA高菌量組中菌量組低菌量組F值P值例數(shù)CRP/（g/L）TNF-α/（ng/L）IL-18/（ng/L）28 42 22 30.71±5.10①②22.77±3.67①11.29±2.34 157.85＜0.001 90.20±15.65①②78.37±12.70①64.01±10.13 23.79＜0.001 251.33±55.36①②204.15±42.08①②163.24±35.19 26.92＜0.001 264.09±58.17①②205.32±45.04①137.62±40.38 39.63＜0.001 33 35 24 34.10±8.14①②21.80±6.22①7.34±1.49 135.06＜0.001 95.37±17.03①②80.15±14.11①53.05±9.28 58.63＜0.001

2.3 MP-DNA表達量與炎性反應(yīng)的關(guān)系 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 表達量與血清CRP、TNF-α、IL-18呈正相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 肺炎支原體-DNA（MP-DNA）表達量與炎性反應(yīng)的關(guān)系（n=92）

2.4 不同菌量組免疫功能指標比較 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 高菌量組血清IgA 較中菌量組、低菌量組低，IgM、IgG 較中菌量組、低菌量組高（P＜0.05），見表4。

表4 咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA（MP-DNA）不同菌量組免疫功能指標比較/（g/L，±s）

表4 咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA（MP-DNA）不同菌量組免疫功能指標比較/（g/L，±s）

注：①與低菌量組比較，P＜0.05。②與中菌量組比較，P＜0.05。

組別咽拭子MP-DNA高菌量組中菌量組低菌量組F值P值肺泡灌洗液MPDNA高菌量組中菌量組低菌量組F值P值例數(shù)IgA IgM IgG 28 42 22 0.93±0.13①②1.10±0.15①1.26±0.18 32.06＜0.001 1.57±0.32①②1.24±0.28①0.98±0.19 28.12＜0.001 8.81±1.20①②7.60±1.13①5.93±0.96 44.73＜0.001 9.31±1.27①②7.82±1.09①4.81±0.85 129.67＜0.001 33 35 24 0.83±0.10①②1.06±0.13①1.49±0.21 96.05＜0.001 1.62±0.34①②1.25±0.26①0.86±0.17 44.19＜0.001

2.5 MP-DNA表達量與免疫功能的關(guān)系 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 表達量與血清IgA 呈負相關(guān)，與血清IgM、IgG呈正相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 肺炎支原體-DNA（MP-DNA）表達量與免疫功能的關(guān)系（n=92）

3 討論

CA-MPP發(fā)病率占肺炎的15%～30%，流行年高達40%～60%，肺部體征多不明顯，起病緩慢，雖為自限性疾病，但近年來重癥CA-MPP 病兒數(shù)量逐漸增多，治療難度高，易引起肺外多系統(tǒng)受累，甚至威脅病兒生命［6-8］。因此，明確病兒病情，積極開展針對性治療，對改善病兒預(yù)后具有重要影響。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MP 釋放的毒素及毒性物質(zhì)可直接對局部組織造成損害，多數(shù)學(xué)者認為MP 感染病兒病情嚴重程度與局部病菌量存在一定相關(guān)性［9-10］。方柯南等［11］針對44 例行支氣管肺泡灌洗術(shù)的重癥MPP 病兒的一項研究發(fā)現(xiàn)，得出病兒急性期咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 復(fù)制水平可作為病情評估的重要指標的結(jié)論。本研究通過對比不同病情程度CA-MPP 病兒的咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA 水平，發(fā)現(xiàn)重癥病兒上述指標水平顯著高于輕癥病兒，由此可見咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA水平與CA-MPP 病兒病情程度有關(guān)，有助于臨床明確病兒病情。其機制是：MP-DNA水平體現(xiàn)MP局部病菌量和復(fù)制能力，其水平增高提示MP 局部病菌量增加，所釋放的毒性物質(zhì)相應(yīng)增加，對病兒組織損傷加重，引起的癥狀更嚴重［12-13］。

關(guān)于MPP 發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子參與炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)及免疫損傷，抗炎系統(tǒng)和促炎系統(tǒng)對抗的結(jié)局，直接決定重癥肺炎的臨床轉(zhuǎn)歸［14］。MP 侵入機體后，刺激淋巴細胞大量分泌TNF-α、IL-18 等多種細胞因子，可促進病情進展、影響病兒預(yù)后［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，CA-MPP 病兒咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 為高菌量的血清CRP、TNF-α、IL-18水平顯著高于中菌量和低菌量病兒，與張晨宇等［16］、徐鳳琴等［17］研究結(jié)果相近。其中TNF-α 為機體免疫防護的重要介質(zhì)，在正常機體中活性較低，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進細胞生成分化等生理功能，同時能參與機體免疫損傷，其水平大量增加可引起、促進炎癥反應(yīng)，加重組織、器官損傷。IL-18屬于前炎癥細胞因子，具有是促進Thl 細胞產(chǎn)生其他相關(guān)細胞因子的作用［18］。史曉云等［19］文獻報道顯示IL-18 是MPP 疾病進展過程中一項重要的細胞因子，可作為預(yù)測難治性MPP 的相關(guān)生物學(xué)指標。CRP 作為臨床最常用炎性指標，其水平升高提示機體炎性反應(yīng)程度加重［20］。進一步經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 表達量與CA-MPP病兒血清CRP、TNF-α、IL-18 表達水平呈正相關(guān)，充分表明咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 可反映機體炎性反應(yīng)情況。

此外，免疫反應(yīng)在MPP 發(fā)生發(fā)展機制中發(fā)揮重要作用［21］。IgA、IgM、IgG 均為反映機體免疫功能的重要指標，本研究結(jié)果中，咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA 表達量與CA-MPP 病兒血清IgA 水平呈負相關(guān)，與血清IgM、IgG 水平呈正相關(guān)，充分表明咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平與CA-MPP 病兒免疫功能關(guān)系密切，可作為反映病兒免疫狀態(tài)的重要指標。當MP 侵入機體后，可引發(fā)一系列免疫應(yīng)答效應(yīng)，不僅包括淋巴T 細胞的通過細胞因子介導(dǎo)的細胞免疫，也包括淋巴B 細胞通過IgA、IgM、IgG 等介導(dǎo)的體液免疫。MP 感染越嚴重，其引起IgA、IgM、IgG變化越明顯。

綜上可知，咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA水平異常增高參與CA-MPP 病兒病情進展，并與病兒炎性反應(yīng)、免疫功能密切相關(guān)，可為病兒病情評估提供客觀依據(jù)，有助于臨床制定針對性治療、干預(yù)措施。