微小RNA-150靶向c-Myb表達(dá)對T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞增殖的影響

楊莉，劉煒，李彥格，管玉潔，毛彥娜

作者單位：鄭州兒童醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科，河南 鄭州 450000

T 淋巴細(xì)胞白血?。═ lymphoblastic leukemia，TLL）是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，來源于骨髓T 淋巴母細(xì)胞，發(fā)病率、病死率較高，具有淋巴結(jié)增大、白血病細(xì)胞浸潤、皮膚損害等特征，因常規(guī)治療易復(fù)發(fā)、化療療效差，長期生存率低，預(yù)后較差，而成為臨床治療的難題［1-3］。微小RNA（miRNA）作為基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，是迄今為止研究較多的一類非編碼RNA，可調(diào)控靶基因廣泛參與血液系統(tǒng)疾病及其他腫瘤的進(jìn)展過程［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-452、miR-139 等表達(dá)異?？蓪?dǎo)致T-LL 的發(fā)生并影響疾病進(jìn)展［6-7］。近年來有文獻(xiàn)報道，miR-150 在慢性髓系白血病中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-150 后可通過調(diào)節(jié)c-Myb 抑制人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562 增殖［8］。然而，關(guān)于miR-150 靶向c-Myb 表達(dá)影響Jurkat 細(xì)胞增殖的報道較少。本研究自2020 年1—6 月研究miR-150 對人T-LL 細(xì)胞株Jurkat 中c-Myb 表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期解釋miR-150 在T-LL 中的功能及分子機(jī)制，為發(fā)展以miRNA為靶點的T-LL治療新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人T-LL 細(xì)胞株Jurkat 細(xì)胞（WD100074，美國ATCC 細(xì)胞庫）；Lipofectamine2000（11668-027，美國Invitrogen）；實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（：K1002S，美國Promega）；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑（CK-04，日本同仁）；AnnexinVFITC/PI（S0185，哈爾濱新?；颍?；c-Myb 抗體（ab117635）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（ab92552）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（ab32503）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（ab181602），美國abcam；羊抗兔（0295G-HRP，美國Santa）；ABI 7500 熒光定量PCR 儀，美國Applied Biosystems；BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀，美國BD；MODEL550 酶標(biāo)儀、ChemiDocXRS 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Jurkat 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%二氧化碳）中培養(yǎng)，融合80%傳代培養(yǎng)。

將Jurkat 細(xì)胞，分為空白對照組、陰性對照組及miR-150 過表達(dá)組，空白對照組Jurka 細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，使用Lipofectamine 2000，向陰性對照組、miR-150 過表達(dá)組Jurka 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染negative control-miR-150、hsa-miR-150 mimic（序列由上海生工合成）。

1.2.2 qRT-PCR 法檢測各組Jurkat 細(xì)胞中miR-150、c-Myb 表達(dá)情況 將Jurkat 細(xì)胞按照“1.2.1”分組處理6 h，重懸于DMEM培養(yǎng)基中，按照1×104個/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，經(jīng)總RNA提取、cDNA 合成后，qRT-PCR 法檢測miR-150（內(nèi)參U6）、c-Myb（內(nèi)參GAPDH）水平。設(shè)置PCR 儀程序為95 ℃10 min；40 次循環(huán)：93 ℃10 s，55 ℃25 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min。 miR-150（F）：5'-AGAGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，miR-150（R）：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；c-Myb（F）：5'-GCTGCTATGGTCTTAGCCTGTAG-3'，c-Myb（R）：5'-ACATCAACAACACACATCTCC-3'；U6（F）：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，（R） ：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；GAPDH（F）：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAA-3'，GAPDH（R）：5'-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'，引物由上海生工合成。2-ΔΔCt法定量。

1.2.3 CCK-8 法檢測Jurkat 細(xì)胞增殖 將Jurkat 細(xì)胞按照“1.2.1”分組處理6 h，重懸于DMEM 培養(yǎng)基中，按照1×104個/孔鋪于培養(yǎng)板（96 孔），48 h 后加CCK-8，2 h后使用酶標(biāo)儀（450 nm）檢測光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測Jurkat 細(xì)胞凋亡 將Jurkat細(xì)胞按照“1.2.1”分組處理6 h，重懸于DMEM 培養(yǎng)基中，按照1×104個/孔鋪于培養(yǎng)板（96孔），48 h后收集、消化、洗滌，調(diào)整成1×106個/毫升的細(xì)胞懸浮液，加入Annexin V-FITC、PI 各5 μL，1 h 避光孵育后使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 熒光素酶實驗檢測miR-150與c-Myb的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)軟件Targetscan 預(yù)測miR-150 和c-Myb mRNA 3'UTR 可能存在的結(jié)合位點。將與miR-150 互補(bǔ)結(jié)合的c-Myb 基因的3'UTR 序列片段插入到pGL3-basic構(gòu)建3'UTR 質(zhì)粒，將空載質(zhì)粒（空載質(zhì)粒組）和3'UTR 質(zhì)粒（3'UTR 質(zhì)粒組）分別與miR-150模擬物共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞。轉(zhuǎn)染36 h后，檢測細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測各組Jurkat 細(xì)胞中c-Myb、PCNA、Bax 蛋白表達(dá)情況 將Jurkat細(xì)胞按照1.2.1分組處理6 h，重懸于DMEM 培養(yǎng)基中，按照1×104個/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，48 h后收集、洗滌、裂解、冰浴、離心，收集上清并進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)PDVF 膜上、TBST 緩沖液（含5%脫脂奶粉）室溫封閉，1 h 后分別加入c-Myb 抗體（1∶1 000 稀釋）、PCNA 抗體（1∶1 000 稀釋）、Bax 抗體（1∶1 000 稀釋）和GAPDH 抗體（1∶1 000 稀釋），孵育過夜，加入1∶5 000 稀釋的羊抗兔二抗，孵育1 h，加入ECL試劑進(jìn)行顯影和曝光，分析條帶灰度，以內(nèi)參蛋白灰度定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0 處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均用±s 表示，行單因素方差分析，采用SNK-q 檢驗進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Jurkat 細(xì)胞中miR-150、c-Myb mRNA表達(dá)情況 Jurkat 細(xì)胞中miR-150、c-Myb mRNA 水平在空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，miR-150 過表達(dá)組Jurkat 細(xì)胞中miR-150 水平升高（P＜0.05），c-Myb mRNA水平降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組Jurkat細(xì)胞中miR-150、c-Myb mRNA表達(dá)水平比較/±s

表1 各組Jurkat細(xì)胞中miR-150、c-Myb mRNA表達(dá)水平比較/±s

注：①較空白對照組，P＜0.05。②較陰性對照組，P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-150過表達(dá)組F值P值c-Myb mRNA 0.98±0.09 1.01±0.05 0.66±0.14①②22.43＜0.001重復(fù)次數(shù)666 miR-150 1.03±0.09 1.02±0.05 1.42±0.14①②31.01＜0.001

2.2 各組Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡情況比較 空白對照組與陰性對照組Jurkat 細(xì)胞OD 值及凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對照組相比，miR-150 過表達(dá)組Jurkat 細(xì)胞OD 值顯著降低，凋亡率顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組Jurkat細(xì)胞的OD值及凋亡率比較/±s

表2 各組Jurkat細(xì)胞的OD值及凋亡率比較/±s

注：①較空白對照組，P＜0.05。②較陰性對照組，P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-150過表達(dá)組F值P值凋亡率/%8.76±0.74 9.13±0.88 20.79±1.15①②318.56＜0.001重復(fù)次數(shù)666 OD值0.46±0.09 0.49±0.08 0.25±0.06①②17.01＜0.001

2.3 miR-150 與c-Myb 的靶向關(guān)系 Targetscan 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-150 和c-Myb mRNA 3'UTR存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與空載質(zhì)粒組相比，3'UTR 質(zhì)粒組Jurkat 細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著降低［（0.68±0.16）比（1.01±0.11），t=4.16，P=0.002］。

2.4 各組Jurkat細(xì)胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白表達(dá)情況 空白對照組與陰性對照組Jurkat 細(xì)胞中c-Myb、PCNA、Bax 蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對照組相比，miR-150 過表達(dá)組Jurkat細(xì)胞中c-Myb、PCNA 蛋白水平降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平升高（P＜0.05），見圖1，表3。

表3 各組Jurkat細(xì)胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白水平比較/±s

表3 各組Jurkat細(xì)胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白水平比較/±s

注：GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①較空白對照組，P＜0.05。②較陰性對照組，P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-150過表達(dá)組F值P值重復(fù)次數(shù)Bax/GAPDH 0.42±0.13 0.46±0.14 0.65±0.18①②3.72 0.042 666 c-Myb/GAPDH 0.64±0.12 0.73±0.13 0.37±0.06①②18.10＜0.001 PCNA/GAPDH 0.56±0.11 0.59±0.13 0.33±0.07①②10.74 0.001

圖1 各組Jurkat細(xì)胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白表達(dá)

3 討論

miRNAs 是一類進(jìn)化中高度保守，分布廣泛，長度為21～24 個核苷酸的非編碼RNA，通過作用于靶基因，使靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或mRNA 降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)。近年來，對miRNA 的深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 基因的突變或表達(dá)失調(diào)與多種癌癥關(guān)系密切，可以通過發(fā)揮抑癌或促癌功能，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，有望成為癌癥的治療靶點［9-10］。miR-150是研究較多的miRNAs 之一，其在多種實體腫瘤中均異常表達(dá)，可用于預(yù)測腫瘤發(fā)生發(fā)展及進(jìn)行預(yù)后評估［11-12］。李均等［13］研究表明，miR-150在宮頸癌組織中高表達(dá)，可能作為癌基因調(diào)控宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展。杜曉陽等［14］研究表明，過表達(dá)miR-150 能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。因此，miR-150 在腫瘤中的調(diào)控具有多樣性，可能發(fā)揮抑癌或促癌功能。王瑩等［15］通過構(gòu)建慢病毒載體過表達(dá)miR-150，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)has-miR-150 可能通過負(fù)調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB（phosphoinositide-3-kinase/serine threonine kinase/nucler factor κB，PI3K/Akt/NFκB）信號通路，抑制Jurkat 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-150后，Jurkat細(xì)胞OD值顯著降低，凋亡率顯著升高，提示miR-150在T-LL進(jìn)展中起抑癌基因作用，這與王瑩研究一致，但具體機(jī)制尚不清楚。

T-LL 的發(fā)生過程是原癌、抑癌基因間作用失衡的后果結(jié)果，其中，癌基因c-Myc 起重要作用，可通過細(xì)胞自噬機(jī)制、非細(xì)胞自噬機(jī)制誘導(dǎo)急性T-LL 表現(xiàn)出明顯的原癌基因成癮性，因此，針對c-Myc 基因進(jìn)行治療可能成為治療急性T-LL 的突破方向［16］。呂國慶等［17］研究表明，c-Myc 抑制劑CPI-203 可明顯抑制急性T 淋巴細(xì)胞白血病Jurkat 細(xì)胞增殖。但c-Myc 缺乏明確的配體結(jié)合域，特異性阻斷c-Myc 基因激活十分困難，研究靶向抑制c-Myc 基因激活的方法具有重要意義［18］。周小翠等［19］研究表明，miR-150通過靶基因c-Myb改善心肌梗死后心肌纖維化。陳連香等［8］研究表明，miR-150 下調(diào)靶基因c-Myb 的表達(dá)抑制慢性髓系白血病細(xì)胞的增殖。何旭等［20］研究發(fā)現(xiàn)，T-LL病兒血漿miR-150水平降低，其水平檢測對T-LL 診斷、病情判斷和預(yù)后評估具有一定作用。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-150 后，Jurkat 細(xì)胞中c-Myc mRNA 和蛋白水平均顯著降低，提示miR-150 在Jurkat 細(xì)胞中可以阻斷c-Myc 基因激活，且雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實，miR-150 在Jurkat細(xì)胞中可以靶向調(diào)控c-Myc基因。

PCNA 是增殖相關(guān)基因，在腫瘤增殖過程中發(fā)揮作用［21］。Bax 是B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的促凋亡成員，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-150 后，Jurkat 細(xì)胞中PCNA 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高，提示miR-150 靶向阻斷c-Myc 基因激活后，通過下調(diào)PCNA 表達(dá)、上調(diào)Bax 表達(dá)抑制Jurkat 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，miR-150 可能靶向c-Myb 表達(dá)，進(jìn)而通過影響PCNA、Bax 表達(dá)抑制Jurkat 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，這可能為靶向治療T-LL 提供了一定參考。