微小RNA-9在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)及意義

陳小霞，謝環(huán)，李曉蘭

作者單位：三峽大學(xué)宜昌市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443000

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈上升趨勢、發(fā)病年齡出現(xiàn)年輕化［1］，對女性生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。盡管現(xiàn)有的臨床診療手段不斷進(jìn)步，早期子宮內(nèi)膜癌病人經(jīng)規(guī)范化治療后，總體生存期不斷延長［2］，但對于進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病人，預(yù)后依然較差，病死率較高［3］。因此，積極探討影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展的早期標(biāo)志物，對該腫瘤早期診療及預(yù)后改善具有重要意義。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一種在轉(zhuǎn)錄后水平通過與mRNA 靶序列結(jié)合而實(shí)現(xiàn)對靶基因的負(fù)性調(diào)控的非編碼RNA，可在多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用［4］。近年來發(fā)現(xiàn)［5］，miRNA 與多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。有研究指出［6］，子宮內(nèi)膜癌干細(xì)胞分化過程中部分miRNA的表達(dá)具有顯著性變化。miR-9 作為一種miRNA，可在體內(nèi)多種組織中表達(dá)并發(fā)揮重要作用［7］。本研究檢測了miR-9 在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)情況，分析了與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012 年4 月至2014 年4 月在三峽大學(xué)宜昌市第二人民醫(yī)院行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌病人，納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療、內(nèi)分泌治療；術(shù)后病理明確為子宮內(nèi)膜癌；術(shù)前無內(nèi)分泌、免疫、代謝性疾??；未失訪，資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌；合并有其他惡性腫瘤。共納入97例，年齡（54.67±9.67）歲，范圍為34～73歲。體重指數(shù)（BMI）（25.35±2.67）kg/m2，按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009 年標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期56 例，Ⅲ～Ⅳ期41例；36 例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同期，留取因子宮肌瘤、脫垂等良性病變行子宮切除手術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織46 份，年齡（55.39±10.15）歲，范圍為32～74歲。本研究通過宜昌市第二人民醫(yī)院醫(yī)院倫理委員 會(huì) 批 準(zhǔn)（ 批 準(zhǔn) 文 號(hào) ：HBSYCSDERMYY201108061136），所有病人均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 術(shù) 用外科剪將子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織剪碎，加入組織研磨機(jī)勻漿，按Trizol總RNA 提取試劑說明（購自美國Invitrogen 公司）提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA 濃度和純度，合格標(biāo)準(zhǔn)：OD260/OD280在1.80～2.20。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)PCR 擴(kuò)增試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）操作步驟，用CFX96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（購自美國Bio-Rad 公司）對引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列：miR-9 正向5’-GCGCGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATG-3’，反向5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3’；U6 正向5’-CTGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。反應(yīng)條件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，73 ℃30 s，循環(huán)38 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中miR-9相對表達(dá)量。

1.2.2 隨訪 術(shù)后第1天開始，對病人進(jìn)行隨訪，包括門診、電話等，隨訪至2019 年4 月30 日，隨訪2～84個(gè)月，記錄病人死亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用±s，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 檢驗(yàn)，多因素因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中miR-9 表達(dá)比較 miR-9 在子宮內(nèi)膜癌組織相對表達(dá)量為（0.25±0.10），在正常子宮內(nèi)膜組織中則為（1.02±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.42，P＜0.001）。

2.2 不同臨床病理指標(biāo)的子宮內(nèi)膜癌組織中miR-9 表達(dá)比較 相比于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)G1～G2 期、浸潤深度＜1/2 肌層、未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，miR-9相對表達(dá)量在Ⅲ～Ⅳ期、G3期、≥1/2肌層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌病人不同臨床病理指標(biāo)中miR-9表達(dá)比較/±s

表1 子宮內(nèi)膜癌病人不同臨床病理指標(biāo)中miR-9表達(dá)比較/±s

指標(biāo)年齡＜55歲≥55歲是否絕經(jīng)例數(shù)miR-9相對表達(dá)量t值1.36 P值0.177 43 54 0.23±0.10 0.26±0.10 1.82 0.073是否40 57 0.23±0.09 0.26±0.10病理學(xué)類型子宮內(nèi)膜腺癌非子宮內(nèi)膜腺癌FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期組織學(xué)分級(jí)G1～G2期G3期浸潤深度＜1/2肌層≥1/2肌層雌激素受體陽性陰性孕激素受體陽性陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.44 0.154 77 20 0.25±0.10 0.22±0.08 3.84＜0.001 56 41 0.28±0.10 0.20±0.09 3.76＜0.001 59 38 0.28±0.10 0.20±0.08 3.89＜0.001 55 42 0.28±0.10 0.21±0.09 1.63 0.106 66 31 0.26±0.10 0.22±0.10 1.78 0.078 61 36 0.23±0.10 0.27±0.10 3.46 0.001是否36 61 0.20±0.08 0.27±0.10

2.3 miR-9 表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌病人生存時(shí)間的影響 選取miR-9 相對表達(dá)量的P25值（0.16），病人分成低表達(dá)組（＜0.16）16 例及高表達(dá)組（≥0.16）71 例，生存分析示，低表達(dá)組生存時(shí)間低于高表達(dá)組［（34.82±5.96）個(gè)月比（69.23±3.12）個(gè)月］，累積生存率低于高表達(dá)組（24.00% 比75.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.37，P＜0.001）。

2.4 影響病人預(yù)后的因素 FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度≥1/2 肌層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miR-9 低表達(dá)是病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素（HR=2.44、2.75、2.26 和0.31，P＜0.05）。

表2 子宮內(nèi)膜癌97例預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

3 討論

子宮內(nèi)膜癌誘發(fā)因素較多，發(fā)病率僅次于宮頸癌，位女性生殖道惡性腫瘤第二位［8］。臨床上對于早期子宮內(nèi)膜癌病人的治療主要以手術(shù)切除輔以放化療，多數(shù)病人病情得到很好控制，5 年生存率不斷提高［9］，但對于晚期及發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病人，死亡率較高，5 年生存率不超過30%［10］。目前，對于子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制及診療標(biāo)志物研究尚處于起步階段，積極尋找有效的分子標(biāo)志物或靶基因?qū)γ鞔_子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制及診療具有重要意義。有研究指出，miRNAs 功能及表達(dá)異常與人類腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)［11］。miRNAs 可在腫瘤發(fā)生中起促癌或抑癌基因功能［12］。有研究指出，miRNAs 基因譜在子宮內(nèi)膜癌組織中出現(xiàn)異常［13］。miR-9 是近年來被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常的miRNA［7］，且在不同類型的惡性腫瘤中既可以扮演癌基因的作用而促進(jìn)腫瘤發(fā)生及血管生成［14］，又可以作為抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)［15］。本研究中，miR-9 在子宮內(nèi)膜癌組織中相對表達(dá)量顯著降低，提示可能發(fā)揮抑癌基因參與了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生。本研究中，相比于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)G1～G2 期、浸潤深度＜1/2 肌層、未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，miR-9 相對表達(dá)量在Ⅲ-Ⅳ期、G3 期、≥1/2 肌層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著降低，說明隨著子宮內(nèi)膜癌惡性程度增加，miR-9 表達(dá)量降低，提示miR-9 低表達(dá)可能參與了子宮內(nèi)膜癌惡性化過程。

有研究指出，miR-9 低表達(dá)與結(jié)直腸癌病人不良預(yù)后相關(guān)，是影響病人預(yù)后的因素［16］。亦有研究指出，miR-9 是膀胱癌切除術(shù)后病人預(yù)后的影響因素［17］。本研究結(jié)果表明，低表達(dá)組生存時(shí)間和累積生存率均低于高表達(dá)組，說明提示miR-9 表達(dá)水平與病人預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，miR-9低表達(dá)是病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，可能是病人預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，miR-9 在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，且是病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，但其作用的分子機(jī)制尚需開展研究明確。