一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定虎杖中6種酚類成分的含量

王敏，王晶，楊娜，張?zhí)祆?，朱懷?/p>

作者單位：1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210008；

2南京臨床藥學(xué)中心，江蘇 南京 210008；

3陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046

虎杖系蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根和根莖，具有清熱解毒、散瘀止痛、利濕化痰之功效［1］?；⒄然瘜W(xué)成分種類繁多，藥理活性研究最多的是虎杖苷和白藜蘆醇等二苯乙烯類成分，其次是以大黃素為代表的蒽醌類成分［2-3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，虎杖中的酚類物質(zhì)具有抗氧化［4］、降血脂［5］、抗腫瘤［6］、抗菌和抗病毒［7］等多種活性。

在虎杖藥材質(zhì)控方面，2020 版《中國(guó)藥典》虎杖的含量測(cè)定項(xiàng)下僅對(duì)虎杖苷和大黃素的含量做出規(guī)定，且虎杖苷和大黃素分別采用不同的HPLC 方法［1］。由此可見，現(xiàn)行的虎杖質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)存在質(zhì)控指標(biāo)少和測(cè)定繁瑣的問題，多成分、多指標(biāo)同時(shí)監(jiān)控的質(zhì)控方法對(duì)于完善虎杖的質(zhì)量研究具有重要意義。

本研究采用一測(cè)多評(píng)法（multi-components by single maker，QAMS），以虎杖苷為內(nèi)參物，同時(shí)測(cè)定虎杖中兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSHG）、白藜蘆醇和大黃素6 種酚類成分，以期為虎杖藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂和完善提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 Shimadzu LC-2030 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Agilent-1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；5417R 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；VORTEX-GENIE2 型旋渦混合器（美國(guó)Scientific Industries 公司）。Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；Phenomenex Kinetex C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5μm）；Waters Xbridge C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）。

1.2 試劑 對(duì)照品虎杖苷（批號(hào)CHB190103）、白藜蘆醇（批號(hào)CHB180228）、TSHG（批號(hào)CHB180810）、兒茶素（批號(hào)CHB180809）、表兒茶素（批號(hào)CHB180831）和大黃素（批號(hào)CHB181208）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司。乙腈為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司；純水由美國(guó)Millipore 公司的MILLI-Q超純水器自制；其余試劑為分析純。從四川、江蘇和湖北采集10批虎杖藥材，所有藥材經(jīng)均經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)副教授王晶鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根和根莖。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 Shimadzu LC-2030 型高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫程序：0～20 min，15%～22%A；20～30 min，22%～95%A；30～35 min，95%A。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm 和310 nm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為5μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品和虎杖供試品溶液的高效液相色譜圖：A為混合對(duì)照品（280 nm）；B為混合對(duì)照品（310 nm）；C為虎杖供試品溶液（280 nm）；D為虎杖供試品溶液（310 nm）

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素對(duì)照品適量，加甲醇至完全溶解制備各對(duì)照品溶液。取各對(duì)照品溶液適量混合，制備含TSHG 和大黃素100 mg/L 以及兒茶素、表兒茶素、虎杖苷和白藜蘆醇300 mg/L混合對(duì)照品儲(chǔ)備液?；旌蠈?duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋2、4、6、10、15 和25 倍后制成混合對(duì)照品工作液。

1.3.3 虎杖供試品溶液的制備 取虎杖粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘14 000轉(zhuǎn)）10 min，取上清液作為供試品溶液。

1.4 相對(duì)校正因子的確定 以虎杖苷為內(nèi)參物（s），建立兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的相對(duì)校正因子（relative correlation factor，RCF）［8］，RCF=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci），其中Ai 為某待測(cè)成分i 的峰面積，Ci 為某待測(cè)成分i 的濃度，As 為內(nèi)參物s的峰面積，Cs為內(nèi)參物s的濃度。

1.5 待測(cè)成分的色譜峰定位 記錄各待測(cè)成分分別在Shimadzu LC-2030 型高效液相色譜儀和Agilent-1100 高效液相色譜儀上，經(jīng)Agilent ZORBAX SB C18色譜柱、Phenomenex Kinetex C18色譜柱和Waters Xbridge-C18色譜柱分離后的保留時(shí)間。采用相對(duì)保留時(shí)間法，計(jì)算待測(cè)成分與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值，并以此作為待測(cè)成分色譜峰定位的依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系 取“1.3.2 對(duì)照品溶液的制備”項(xiàng)下系列濃度的混合對(duì)照品工作液各5μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的峰面積。以待測(cè)物濃度（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸。測(cè)定結(jié)果如表1 所示，6種酚類物質(zhì)在所考察的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 6種酚類物質(zhì)的線性回歸方程

2.1.2 精密度 配制低、中、高濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“1.3.1 色譜條件”項(xiàng)下條件，一個(gè)分析批內(nèi)，連續(xù)測(cè)定6次，考察精密度。結(jié)果顯示，兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素峰面積的RSD 分別為1.23%、1.76%、1.09%、3.12%、3.97%和0.98%，表明方法的精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性 按照“1.3.3 虎杖供試品溶液的制備”項(xiàng)下平行制備6 份供試品溶液，按照“1.3.1 色譜條件”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示虎杖供試品中兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素峰面積的RSD 分別為3.23%、2.31%、1.34%、4.09%、2.87%和2.17%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性 取同一樣品溶液分別于0、4、8、12和24 h進(jìn)樣，測(cè)定兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的峰面積，計(jì)算RSD 進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果顯示，兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素峰面積的RSD 分別為2.34%、3.23%、2.89%、3.45%、4.78%和2.69%，表明虎杖供試品溶液中待測(cè)定的6種酚類物質(zhì)24 h內(nèi)均有較好的穩(wěn)定性。

2.1.5 加樣回收率 取已知各待測(cè)成分含量的虎杖飲片粉末9 份，分別精密加入相當(dāng)于供試品中各待測(cè)成分50%、100%和150%的混合對(duì)照品溶液［9］，按“1.3.3 虎杖供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.1 色譜條件”進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的平均加樣回收率及RSD 分別為98.97%（3.63%）、102.37%（3.10%）、99.89%（3.27%）、100.85%（3.75%）、98.34%（3.58%）和101.04%（2.14%）。

2.2 相對(duì)校正因子的確定 取混合對(duì)照品溶液，按照“1.3.1 色譜條件”項(xiàng)下條件平行進(jìn)樣3 次分析，記錄各對(duì)照品色譜峰的面積，取平均值，計(jì)算相對(duì)校正因子?；⒄溶兆鰞?nèi)參物，兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的相對(duì)校正因子的RSD均小于5%，符合試驗(yàn)要求。

2.3 相對(duì)校正因子的耐用性評(píng)價(jià)

2.3.1 不同色譜柱系統(tǒng)對(duì)RCF 的影響 采用Shimadzu LC-2030型高效液相色譜儀和Agilent-1100高效液相色譜儀，分別考察Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Kinetex C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和Waters Xbridge C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）對(duì)各待測(cè)成分RCF 的影響。結(jié)果（表2）顯示，兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的RCF 的RSD 均小于5%，表明RCF 在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱上的穩(wěn)定性和耐用性較好。

2.3.2 不同柱溫對(duì)RCF 的影響 采用Shimadzu LC-2030 型高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），考察不同柱溫（38、40、42 ℃）對(duì)RCF的影響。結(jié)果（表2）顯示，兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的RCF 的RSD均小于5%，表明RCF在不同柱溫下的穩(wěn)定性較好。

2.3.3 不同流動(dòng)相體積流量對(duì)RCF 的影響 采用Shimadzu LC-2030 型高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察不同流動(dòng)相體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）對(duì)RCF 的影響。結(jié)果（表2）顯示，兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素RCF 的RSD 均小于5%，表明流動(dòng)相體積流量對(duì)待測(cè)成分RCF無顯著影響。

表2 不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.4 待測(cè)成分的色譜峰定位 采用相對(duì)保留時(shí)間法，計(jì)算待測(cè)成分與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值，結(jié)果（表3）顯示，以虎杖苷為內(nèi)參物，兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%，表明待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小，可用于待測(cè)成分的色譜峰定位。

表3 待測(cè)成分與內(nèi)參物對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的比較

2.5 QAMS 和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 10 批虎杖藥材按照“1.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“1.3.1 色譜條件”進(jìn)樣分析，分別采用QAMS和外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量。在QAMS 方法應(yīng)用時(shí)，除內(nèi)參物虎杖苷按外標(biāo)法計(jì)算濃度，其余待測(cè)成分按Ci= f×Cs×（Ai/As）計(jì)算濃度。將QAMS 和外標(biāo)法所測(cè)得的待測(cè)物濃度采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果（表4）顯示各待測(cè)物P 值均大于0.05，表明QAMS 和外標(biāo)法兩種方法的檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 虎杖中6種酚類物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果/（mg/g）

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 本研究所測(cè)定的化合物種類包含二苯乙烯類、蒽醌類和鞣質(zhì)類。采用DAD 全波長(zhǎng)掃描6 種待測(cè)成分，兒茶素和表兒茶素在202 nm和278 nm處有較大吸收，TSHG在317 nm處有較大吸收，虎杖苷和白藜蘆醇在309 nm 處有較大吸收，而大黃素在254 nm和287 nm處有較大吸收。比較不同波長(zhǎng)下的基線干擾、色譜峰峰形和分離度等信息，最終確定虎杖苷、白藜蘆醇和TSHG 的檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm，兒茶素、表兒茶素和大黃素的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

3.2 內(nèi)標(biāo)物和含量測(cè)定指標(biāo)的選擇 就虎杖藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制而言，2020 版《中國(guó)藥典》僅對(duì)其中的虎杖苷和大黃素的含量做出規(guī)定，且虎杖苷和大黃素分別采用不同的熱回流提取方法和色譜分離檢測(cè)方法，方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣。為解決這一問題，研究人員進(jìn)行了不斷的探索。陳黎等［10］采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立了同時(shí)測(cè)定虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇等11 種指標(biāo)性成分含量的方法，并將該方法成功應(yīng)用于3 批虎杖藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)?？椎玛训龋?1］采用高效液相色譜法比較分析了虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素等5 種活性成分在其根木質(zhì)部、根莖木質(zhì)部和根表皮等不同根部位中的含量，為虎杖藥材的采收和資源合理應(yīng)用提供了一定的參考。多成分同步質(zhì)量控制模式是現(xiàn)階段中藥質(zhì)量控制的趨勢(shì)。在傳統(tǒng)的基于對(duì)照品的多成分同時(shí)定量的基礎(chǔ)上，QAMS 法應(yīng)運(yùn)而生，并得到迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于酸棗仁［12］、板藍(lán)根［13］和紅參［14］等多種中藥的質(zhì)量控制。QAMS法以中藥材中某一指標(biāo)性成分為內(nèi)參物，根據(jù)各指標(biāo)性成分間信號(hào)響應(yīng)的內(nèi)在關(guān)系，計(jì)算其他指標(biāo)性成分與內(nèi)參物之間的相對(duì)校正因子，通過內(nèi)參物標(biāo)準(zhǔn)曲線和相對(duì)校正因子換算其他指標(biāo)性成分的量。在無法提供所有指標(biāo)性成分對(duì)照品的情況下，QAMS法可實(shí)現(xiàn)以一種成分為對(duì)照，同時(shí)測(cè)定多種成分的含量，在推廣應(yīng)用中可一定程度上解決中藥對(duì)照品匱乏和實(shí)驗(yàn)成本高的問題。

在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制領(lǐng)域，原則上應(yīng)選擇中藥中藥理作用比較明確的有效成分或與中藥臨床功效具有相關(guān)性的成分為指標(biāo)性成分。除2020 版《中國(guó)藥典》虎杖的含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定的虎杖苷和大黃素外，多項(xiàng)研究顯示虎杖中白藜蘆醇具有抗腫瘤［6］、抗菌和抗病毒［7］功效，TSHG 具有抗炎、抗抑郁、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性［15］，而兒茶素和表兒茶素具有抗氧化、抗炎、改善心腦血管疾病癥狀以及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。綜上所述，本論文選取藥理作用明確的兒茶素、表兒茶素、虎杖苷、TSHG、白藜蘆醇和大黃素6 種酚類成分作為含量測(cè)定指標(biāo)。基于高效液相色譜儀建立了6種酚類成分同時(shí)定量分析的方法，并從線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率等方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示所建立的方法滿足中藥成分含量測(cè)定要求［16］，可用于虎杖藥材中6種酚類成分的定量。

3.3 QAMS 法用于虎杖藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià) 鑒于白藜蘆醇［17］光穩(wěn)定性差，本研究選取虎杖最具代表性的成分虎杖苷為內(nèi)參物，建立兒茶素、表兒茶素、TSHG、白藜蘆醇和大黃素的相對(duì)校正因子，并從不同儀器、色譜柱、流速和柱溫等多個(gè)方面考察了相對(duì)校正因子的耐用性。結(jié)果顯示，各種考察的因素對(duì)相對(duì)校正因子的影響RSD 均小于5%，可見各成分相對(duì)校正因子穩(wěn)定性均較好。本研究采用t 檢驗(yàn)比較QAMS 法和外標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示兩種方法所得虎杖中6 種酚類含量值之間無顯著性差異。相比于質(zhì)譜法［10］定量，本研究所采用的高效液相色譜紫外檢測(cè)法具有經(jīng)濟(jì)適用、穩(wěn)定性好和易于推廣的優(yōu)勢(shì)；相比于傳統(tǒng)的基于對(duì)照品的多成分同時(shí)定量方法［10-11］，本研究所建立的QAMS 法以一種成分為內(nèi)參物定量其他成分，具有分析成本低和分析效率高的優(yōu)勢(shì)［18］。

綜上所述，QAMS 法穩(wěn)定可靠，以一種指標(biāo)性成分為內(nèi)參物即可測(cè)定多種成分的含量，在節(jié)約標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)成分的同時(shí)，增加了檢測(cè)的便利性。QAMS 法可更加快速簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)虎杖藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制。