霸王花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

廖萬忠，蔣偉哲，劉 微，周賢強(qiáng)，劉雪萍，付書婕#（.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 5300；.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，南寧 53003）

霸王花為仙人掌科植物量天尺Hylocereus undatus（Haw.）Britt.et Rose 的干燥花，又名霸王鞭、三棱箭、劍花、龍骨花等，始載于《嶺南采藥錄》。該藥味甘、性微寒，常生長于海拔3～300 m處，在世界各地均有廣泛栽培，于1645年引入我國，現(xiàn)被廣泛種植于我國廣東、廣西、福建、海南等地[1]。霸王花具有潤肺止咳、祛痰平喘、潤腸通便、抑菌、抗氧化、提高免疫力等功效，主治咳嗽、支氣管炎、肺炎、肺結(jié)核、便秘等疾病[2－4]；此外，因富含多種人體必需氨基酸、植物纖維及微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，霸王花又被廣泛用作蔬菜食用[5]。相關(guān)研究表明，該藥的活性成分主要為黃酮、多糖和皂苷等成分[6－8]，其中山柰酚、異鼠李素等黃酮類成分對呼吸道疾病具有較好的治療作用[9－10]。因此，結(jié)合霸王花的主要功效，上述黃酮類成分可作為定性定量指標(biāo)以控制霸王花質(zhì)量。目前，國家藥材標(biāo)準(zhǔn)尚未收載霸王花，《中國植物志》第52卷、《中藥大辭典》下冊等中藥典籍雖有收載，但僅有藥材來源和性狀鑒別，缺少顯微鑒別、薄層鑒別、含量測定等相關(guān)質(zhì)量控制內(nèi)容。為此，本研究擬對15批霸王花藥材進(jìn)行性狀、顯微、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）鑒別，測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物，并對其中山柰酚、異鼠李素進(jìn)行含量測定，旨在建立霸王花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為有效控制其藥材質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），101-3SB 型電熱恒溫干燥箱（紹興市蘇珀儀器有限公司），GMP3-10 型程控馬弗爐（杭州卓馳儀器有限公司），KS-500DB 型數(shù)控超聲清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

異鼠李素對照品（批號(hào)110860-202012，純度99.10%）購自中國食品藥品檢定研究院，山柰酚對照品（批號(hào)RP200312，純度99.83%）購自成都麥德生科技有限公司；霸王花對照藥材（批號(hào)290111-202107）購自江西佰草源生物科技有限公司；4%醋酸鈉硅膠G 薄層板購自青島海洋化工有限公司；甲醇（色譜純）購自美國Merck公司，乙腈（色譜純）購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，磷酸（分析純）購自煙臺(tái)市雙化工有限公司，其余試劑均為分析純，水為超純水。

霸王花藥材（編號(hào)S1～S15，具體來源信息見表1）均購自廣西、廣東，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑤醫(yī)藥學(xué)院謝陽姣研究員鑒定均為仙人掌科植物量天尺H.undatus（Haw.）Britt.et Rose 的干燥花。上述藥材經(jīng)粉碎后過3號(hào)篩，置于干燥箱中，備用。

表1 15批霸王花藥材的來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品為棕褐色或黃棕色干燥花，呈不規(guī)則的長條束狀，長15～25 cm；萼管細(xì)長部扭曲呈條束狀，但基部仍相連接；花外側(cè)覆蓋有皺縮的鱗片，內(nèi)側(cè)著生多數(shù)雄蕊，花絲線形，花藥扁平呈黃白色；上端花被呈狹長披針形，有縱脈，往往數(shù)輪連在一起；氣微，味稍甜。結(jié)果見圖1。

圖1 霸王花藥材（編號(hào)S7）性狀鑒別圖

2.2 顯微鑒別

按照2020 年版《中國藥典》（四部）通則“2001 顯微鑒別法”項(xiàng)下方法，取藥材粉末（編號(hào)S7）適量，制片后觀察[11]。本品粉末呈棕綠色或棕黃色；花粉粒呈黃色，類球形，直徑18～26 μm，表面有顆粒狀雕紋，具3 個(gè)萌發(fā)孔；非腺毛為單細(xì)胞，甚長，多彎曲；粉末中可見導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞。結(jié)果見圖2。

圖2 霸王花藥材粉末顯微鑒別圖

2.3 TLC鑒別

精密稱取藥材粉末1 g，加石油醚（60～90 ℃）20 mL，回流（水浴溫度為80 ℃，下同）提取30 min；棄去石油醚液，藥渣揮干后加甲醇25 mL，再回流提取30 min；濾過，取濾液15 mL與4 mol/L稀鹽酸5 mL混合，回流提取15 min；濾過，得回流液；取回流液10 mL，濃縮至3 mL，加水15 mL，轉(zhuǎn)入分液漏斗，用乙酸乙酯20 mL萃取2 次，合并乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，即得供試品溶液。取對照藥材粉末適量，同法制得對照藥材溶液。另取山柰酚、異鼠李素對照品適量，用甲醇分別制成0.2 mg/mL山柰酚對照品溶液和0.1 mg/mL異鼠李素對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）通則“0502 TLC 法”項(xiàng)下方法操作[11]。吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一4%醋酸鈉硅膠G 薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶5∶1，V/V/V）溶液為展開劑展開；取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干至斑點(diǎn)清晰，然后在紫外燈（波長365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且分離度較好。結(jié)果見圖3。

圖3 霸王花藥材TLC圖

2.4 水分、灰分、浸出物檢測

2.4.1 水分 取各批次霸王花藥材粉末，按照2020年版《中國藥典》（四部）通則“0832 水分測定法”項(xiàng)下“第二法（烘干法）”進(jìn)行檢測[11]。每批樣本平行測定3次，取平均值（表2）。結(jié)果顯示，15批霸王花藥材水分為10.70%～12.23%，平均值為11.44%。南方氣候較為潤濕，且15批藥材水分最高值為12.23%，結(jié)合儲(chǔ)藏過程中對水分控制的要求[12]，擬定霸王花藥材的水分不得過13.0%。

表2 霸王花藥材中水分、灰分、浸出物測定結(jié)果（n＝3，%）

2.4.2 灰分 取各批次霸王花藥材粉末，按照2020年版《中國藥典》（四部）通則“2302 灰分測定法”項(xiàng)下“總灰分測定法”和“酸不溶性灰分測定法”進(jìn)行檢測[11]。每批樣本平行測定3次，取平均值（表2）。結(jié)果顯示，15批霸王花藥材總灰分為7.48%～11.29%，平均值為9.51%；酸不溶性灰分為0.25%～0.70%，平均值為0.46%。以平均值上浮20%為標(biāo)準(zhǔn)[13]，擬定霸王花藥材的總灰分不得過12.0%；酸不溶性灰分因?qū)崪y值較小，暫不作限度要求。

2.4.3 浸出物 取各批次霸王花藥材粉末，按照2020年版《中國藥典》（四部）通則“2201 浸出物測定法”項(xiàng)下“水溶性浸出物（熱浸法）”和“醇溶性浸出物測定法（熱浸法）”進(jìn)行檢測，后者所用溶劑為60%乙醇[11]。每批樣本平行測定3次，取平均值（表2）。結(jié)果顯示，15批霸王花藥材水溶性浸出物為30.34%～49.91%，平均值為40.13%；醇溶性浸出物為25.27%～36.92%，平均值為32.33%。以平均值下調(diào)20%為標(biāo)準(zhǔn)[13]，結(jié)合15 批藥材浸出物測得量，擬定水溶性浸出物不得少于30.0%，醇溶性浸出物不得少于25.0%。

2.5 含量測定

2.5.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取山柰酚、異鼠李素對照品適量，加甲醇制成上述2個(gè)成分質(zhì)量濃度分別為100.356、58.730 μg/mL的混合對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末0.5 g，置于100 mL 錐形瓶中，加甲醇20 mL、4 moL/L 稀鹽酸5 mL，稱定質(zhì)量，80 ℃加熱回流提取1 h，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.4%磷酸溶液（53∶47，V/V）為流動(dòng)相；檢測波長為362 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。分別取供試品溶液（編號(hào)S7）、混合對照品溶液和空白溶液[甲醇-4 mol/L稀鹽酸（4∶1，V/V）]，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖4）。結(jié)果顯示，各待測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度良好，理論板數(shù)均不低于3 000，且空白溶液對待測成分的測定無干擾，表明該方法的專屬性較好。

圖4 山柰酚和異鼠李素系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的高效液相色譜圖

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、3、4、5 mL，用甲醇稀釋至10 mL，得各稀釋液。取混合對照品溶液和上述各稀釋液適量，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得山柰酚和異鼠李素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍（表3）。結(jié)果顯示，各成分在其檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好（r＞0.999）。

2.5.5 檢測限與定量限考察 取“2.5.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，用甲醇逐步稀釋，然后按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。分別以信噪比3∶1、10∶1計(jì)算山柰酚和異鼠李素的檢測限、定量限（表3）。結(jié)果顯示，山柰酚和異鼠李素的檢測限和定量限均滿足定量檢測要求[11]。

表3 山柰酚和異鼠李素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限

2.5.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，山柰酚、異鼠李素峰面積RSD 分別為0.56%、0.56%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取霸王花藥材粉末（編號(hào)S7）適量，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，山柰酚、異鼠李素峰面積RSD 分別為0.56%、0.64%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批霸王花藥材粉末（編號(hào)S7）6份，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，山柰酚、異鼠李素含量的RSD 分別為0.47%、0.90%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的霸王花藥材粉末（編號(hào)S7）6 份，每份約0.1 g，精密稱定，精密加入“2.5.1”項(xiàng)下混合對照品溶液3 mL，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，山柰酚、異鼠李素的平均加樣回收率分別為103.63%、98.00%，RSD分別為1.23%、1.15%（n＝6），表明本方法的準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表4。

表4 山柰酚和異鼠李素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.5.10 樣品含量測定 取15 批霸王花藥材粉末，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。每批樣品平行測定3次，取平均值（表5）。結(jié)果顯示，15批霸王花樣品中山柰酚和異鼠李素含量分別為1.787～3.785、0.597～2.211 mg/g。因不同產(chǎn)地含量差異較大，故以含量最低值設(shè)限[14]，即按干燥品計(jì)算，初步擬定霸王花藥材中山柰酚和異鼠李素含量分別不得少于1.780、0.590 mg/g。

表5 15批霸王花藥材中山柰酚和異鼠李素的含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 定性和定量分析指標(biāo)的選擇

現(xiàn)有研究表明，霸王花藥材中含有豐富的黃酮類成分，如山柰酚、異鼠李素、槲皮素等[15]。山柰酚具有潤肺止咳、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用[16－17]；異鼠李素具有抗支氣管炎、抗氧化、抗腫瘤和降血壓等作用[10，18]。山柰酚和異鼠李素的藥理作用與霸王花潤肺止咳、抗氧化的藥用功效相似，提示這2個(gè)成分可能是該藥的有效成分。因此，本研究選擇山柰酚和異鼠李素作為霸王花藥材定性和定量分析的指標(biāo)成分。

3.2 TLC鑒別條件的選擇

在TLC鑒別條件的選擇中，本課題組考察了超聲提取法與回流提取法對鑒別結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，超聲提取法所得供試品溶液的雜質(zhì)斑點(diǎn)多，主斑點(diǎn)不明顯，故選擇回流提取法；本課題組考察了不同薄層板對鑒別結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，山柰酚、異鼠李素與其他組分在硅膠G 薄層板中難以有效分離，而選擇4%醋酸鈉硅膠G 薄層板則可得到理想的分離效果；本課題組參考文獻(xiàn)[19－20]，考察了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（10∶3∶1，V/V/V）、正己烷-甲酸甲酯-甲酸（8∶4∶1，V/V/V）、石油醚-三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（2∶10∶3∶1，V/V/V）、甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶5∶1，V/V/V）等不同展開劑對鑒別結(jié)果的影響，最終選擇了斑點(diǎn)清晰、圓整、分離度高、重復(fù)性好的甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶5∶1，V/V/V）作為展開劑。

3.3 高效液相色譜條件和供試品溶液制備條件的選擇

在高效液相色譜條件的優(yōu)化研究中，本課題組通過將對照品溶液和供試品溶液于200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，篩選出山柰酚、異鼠李素的最大吸收波長（362 nm）。本課題組對流動(dòng)相組成（甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸溶液）、甲醇-0.4%磷酸溶液比例（50∶50、53∶47、55∶45，V/V）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等色譜條件進(jìn)行了考察，對比各成分分離度及基線平穩(wěn)情況，最終選定“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件。此外，本課題組還考察了樣品提取方式（超聲提取、回流提取）、提取溶劑（甲醇、水）、鹽酸濃度（1、2、3、4、5 moL/L）等供試品溶液的制備條件[21]，最終選擇了待測成分色譜峰峰形對稱無拖尾、雜質(zhì)峰種類少且響應(yīng)較弱的“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液制備條件。

3.4 樣品含量測定結(jié)果分析

本研究表明，不同省份、同一省份不同產(chǎn)地之間的霸王花藥材成分含量差異較大：廣西6個(gè)產(chǎn)地樣品中山柰酚的含量為1.902～2.809 mg/g，異鼠李素的含量為0.804～1.444 mg/g；廣東9 個(gè)產(chǎn)地樣品山柰酚的含量為1.787～3.785 mg/g，異鼠李素的含量為0.597～2.211 mg/g。這可能是因?yàn)樗幉漠a(chǎn)地地理位置、氣候環(huán)境和采收時(shí)間等不同，導(dǎo)致指標(biāo)成分的動(dòng)態(tài)累積含量不同以及部分化學(xué)成分有所差異，加上此類藥材體積較大、部位較多，使得樣品采集不均一，最終導(dǎo)致各地樣品成分含量差異較大。

綜上所述，本研究對霸王花藥材進(jìn)行了定性鑒別和水分、灰分、浸出物測定，并對其中山柰酚、異鼠李素的含量進(jìn)行測定，初步擬定了各指標(biāo)的限度標(biāo)準(zhǔn)，為該藥材的質(zhì)量控制提供了參考方案，有利于推動(dòng)其資源的開發(fā)與應(yīng)用。但本研究收集的霸王花藥材來源局限于廣西、廣東兩地，為更加科學(xué)有效地完善其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本課題組今后將對更多產(chǎn)地的霸王花藥材進(jìn)行研究。