藏藥鴨嘴花的指紋圖譜建立、化學模式識別及含量測定Δ

干志強，熊雙鳳，鐘 镥2，3，，羅晴方2，3，，張 藝2，3，#（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學術傳承創(chuàng)新研究中心，成都 611137；3.成都中醫(yī)藥大學中成藥質量評價重點實驗室，成都 611137；.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137）

本課題組前期調查發(fā)現(xiàn)，鴨嘴花在各地藏醫(yī)院、制藥企業(yè)的實際使用中存在著基原復雜、多品種混用的現(xiàn)象[10]，且該藥現(xiàn)有質量標準（2005年版《云南省中藥材標準（第3冊）》）只有薄層鑒別和水分、浸出物檢查，沒有含量測定等內容[11]；同時，通過查詢中國知網發(fā)現(xiàn)，其質量評價的相關文獻較少。這使得其質量難以得到有效控制，給制劑生產和臨床應用造成了一定的安全隱患。本課題組前期以鴨嘴花為對象，依次開展了本草考證、藥效物質基礎研究等一系列工作[10，12]，得出了生物堿類成分較符合其藥性、藥效特點這一結論[13]，并進一步對其質量標準進行了完善[14]。在此基礎上，本研究結合現(xiàn)有文獻報道[15]，選用鴨嘴花中含量相對較高且研究相對集中的藥效成分鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿作為指標，建立高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）指紋圖譜并測定其含量，同時結合化學模式識別方法進一步分析，以期能夠綜合、全面地評價鴨嘴花藥材的質量，為有效控制其品質提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-2030C 3D Plus 型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、SB5200D型超聲清洗儀（寧波新藝超聲設備有限公司）、D2-8 型超純水制備儀（成都寶賽思科技有限公司）、BP121S 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、AE224型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

11 批鴨嘴花藥材采集或購買自我國西藏、四川、云南3個省份，經成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院張藝研究員鑒定為爵床科鴨嘴花屬植物鴨嘴花A.vasicaNees.的干燥枝和葉（具體來源信息見表1）；鴨嘴花堿對照品（批號Y-164-190701，純度＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；鴨嘴花酮堿對照品為本課題組前期分離所得（結構經核磁共振氫譜、核磁共振碳譜確證，純度＞98%）[13]；甲醇為色譜醇，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 11批鴨嘴花樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Thermo Hypersil GoldTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇為流動相A、0.1%磷酸溶液為流動相B 進行梯度洗脫（0～10 min，5%A；10～30 min，5%A→15%A；30～47 min，15%A→25%A；47～92 min，25%A→30%A）；檢測波長為283 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取鴨嘴花藥材（編號S10）粉末（過四號篩，下同）0.5 g，置于25 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率720 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，稱定質量，用相同溶劑補足減失的質量，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿對照品適量，加50%甲醇，分別制成每1 mL含鴨嘴花堿0.809 mg、鴨嘴花酮堿0.746 mg 的單一儲備液。分別吸取上述儲備液1、0.5 mL，用50%甲醇定容于10 mL 量瓶中，得兩種成分質量濃度分別為0.080 9、0.037 3 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以鴨嘴花堿為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD分別為0.30%～2.18%、0.29%～2.96%（n＝6），說明方法精密度較好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，共6 份，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以鴨嘴花堿為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 分別為0.21%～2.90%、0.46%～2.98%（n＝6），說明方法重復性較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時照“2.1.1”項下條件進樣分析，以鴨嘴花堿為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 分別為0.87%～2.56%、0.71%～2.75%（n＝6），說明樣品在室溫下放置24 h內穩(wěn)定。

2.1.7 指紋圖譜的建立 取11批鴨嘴花樣品，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。將所得各批次樣品的色譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以時間窗寬度0.1 min 為條件、S10（色譜響應適中且采樣量大）圖譜為參照，采用平均數(shù)法，經多點校正后生成指紋圖譜的共有模式[16]，得疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），結果見圖1。

圖1 11批鴨嘴花樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜

2.1.8 共有峰的指認 綜合11批樣品的色譜信息，選擇分離度、穩(wěn)定性、重復性較好的色譜峰為共有峰，共標定了23個共有峰。經與混合對照品溶液的HPLC圖（圖2）比對，指認了其中2個色譜峰，分別為鴨嘴花堿（2號峰）和鴨嘴花酮堿（4號峰）。因鴨嘴花堿的峰面積較大且分離度較好，故選其為參照峰。

圖2 混合對照品溶液的HPLC圖

2.1.9 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》對11 批鴨嘴花樣品進行相似度評價。結果顯示，與對照指紋圖譜（R）相比，所有樣品的相似度均不低于0.920，表明11 批鴨嘴花藥材的整體品質較穩(wěn)定。結果見表2。

表2 11批鴨嘴花樣品的相似度評價結果

2.2 化學模式識別分析

2.2.1 聚類分析 將11 批鴨嘴花樣品指紋圖譜共有峰的峰面積導入SPSS 25 軟件進行聚類分析，采用組間連接法，以平方歐氏距離為測度[17]，結果見圖3。由圖3 可知，當距離為25 時，11 批鴨嘴花樣品被分為2 類，即S1～S8 為一類、S9～S11 為一類；當距離為14 時，S9 與S10～S11被進一步區(qū)分。上述結果表明，產自相同省份的鴨嘴花藥材成分普遍較為一致（西藏產的S1、S4，云南產的S2、S3、S5～S8，四川產的S10、S11），且產自西藏與云南的鴨嘴花藥材具有一定的相似性；但當距離不同時，來源相同的鴨嘴花藥材品質也可能存在差異（產自云南的S8和S9）。結合鴨嘴花的指紋圖譜可以看出，S8樣品中的11、13、16、17、20 號峰普遍高于其他批次鴨嘴花樣品，S9 樣品中的21 號峰與其他批次樣品存在明顯差異，這可能是造成這2批樣品區(qū)別于其他批次樣品的主要原因。

圖3 11批鴨嘴花樣品的聚類分析樹狀圖

2.2.2 主成分分析 為進一步探討這11 批鴨嘴花樣品化學成分之間的差異，本研究應用SIMCA 14.1 軟件對鴨嘴花指紋圖譜共有峰的峰面積進行了主成分分析，結果得分矩陣圖的解釋率參數(shù)R2X為0.997，累計解釋能力參數(shù)Q2為0.723，以上參數(shù)均大于0.5，表明模型穩(wěn)定且預測準確性較好[18]。由得分圖（圖4）可知，S9、S10～S11分別為一類，S1～S8被進一步分為較為接近的2類（S1、S4為一類，S2～S3、S5～S8為一類），基本證實了聚類分析的結果。

圖4 11批鴨嘴花樣品的主成分分析得分圖

2.2.3 正交偏最小二乘法-判別分析 在“2.2.2”項下主成分分析的基礎上，本研究以共有峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進一步對不同批次的鴨嘴花樣品進行了正交偏最小二乘法-判別分析。在建立的正交偏最小二乘法-判別分析模型中，解釋率參數(shù)R2X為0.999，區(qū)分參數(shù)R2Y為0.983，累計解釋能力參數(shù)Q2為0.743，以上參數(shù)均大于0.5，表明模型穩(wěn)定且預測準確性較好[18]。從得分圖（圖5）來看，11批鴨嘴花樣品可分為4類，呈現(xiàn)出與聚類分析和主成分分析類似的結果。

圖5 11 批鴨嘴花樣品的正交偏最小二乘法-判別分析得分圖

本研究進一步以變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0為標準[19－20]，以11批樣品的共有峰峰面積為變量，篩選影響各批次樣品質量的差異性成分。由各共有峰的VIP 值（圖6）可知，VIP值＞1.0的共有峰分別為2、16、21、17、1、13號峰，其對應的成分可能是造成11 批鴨嘴花樣品質量差異的主要原因，為差異性成分。

圖6 11批鴨嘴花樣品各共有峰的VIP圖

2.3 含量測定

采用HPLC 法測定鴨嘴花藥材中藥效成分鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿的含量。

2.3.1 色譜條件 以Thermo Hypersil GoldTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95，V/V）為流動相；檢測波長為283 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；檢測時間為30 min。

2.3.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 同“2.1.3”項。

2.3.4 空白溶液的制備 取50%甲醇適量，作為空白溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別取“2.3.2”“2.3.3”“2.3.4”項下供試品溶液（編號S10）、混合對照品溶液、空白溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。由所得色譜圖（圖7）可知，各待測成分色譜峰的分離度均不低于1.5，理論板數(shù)均不低于3 000，空白溶液對2種成分的測定無干擾。

圖7 混合對照品溶液、鴨嘴花供試品溶液和空白溶液的HPLC圖

2.3.6 線性關系考察 取“2.3.3”項下儲備液適量，加50%甲醇，制成鴨嘴花堿質量濃度分別為0.020、0.040、0.080、0.161、0.323、0.647 mg/mL，鴨嘴花酮堿質量濃度分別為0.009、0.018、0.037、0.074、0.149、0.298 mg/mL 的系列混合線性工作溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測成分峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得鴨嘴花堿回歸方程為Y＝3×107X+60 576（r＝0.999 5）、鴨嘴花酮堿回歸方程為Y＝1×107X－21 892（r＝0.999 1）。結果顯示，鴨嘴花堿在0.020～0.647 mg/mL、鴨嘴花酮堿在0.009～0.298 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液（編號S10），照“2.3.1”項下色譜條件進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿峰面積的RSD 分別為0.72%、0.57%（n＝6），表明方法精密度較好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿峰面積的RSD 分別為0.98%、0.78%（n＝6），表明供試品在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性較好。

2.3.9 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，共6 份，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并采用標準曲線法計算各成分含量。結果顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿含量的RSD 分別為1.07%、0.71%（n＝6），說明方法重復性較好。

2.3.10 加樣回收率試驗 稱取已知含量的鴨嘴花樣品（編號S10），共6 份，分別按已知量的100%加入混合對照品溶液（按“2.3.3”項下方法制得）適量，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。試驗結果（表3）顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿的平均加樣回收率分別為99.99%（RSD＝1.53%，n＝6）、99.06%（RSD＝1.83%，n＝6），說明方法準確性較好。

表3 鴨嘴花堿和鴨嘴花酮堿的加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.3.11 樣品含量測定 取11批鴨嘴花樣品粉末0.5 g，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件平行進樣測定2次，記錄峰面積并采用標準曲線法計算各成分含量。由檢測結果（表4）可知，11批鴨嘴花樣品中，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿的含量分別為4.12～10.22、0.60～3.26 mg/g，提示不同產地鴨嘴花藥材中上述化學成分的含量差異較大。

表4 鴨嘴花藥材含量測定結果（n＝2，mg/g）

3 討論

3.1 指標成分的確定

通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，藏藥鴨嘴花的現(xiàn)代藥理學研究報道較少，相關化合物的藥理學研究主要集中在抗炎、抗腫瘤、抗菌作用等方面，其中鴨嘴花堿和鴨嘴花酮堿被證實具有顯著的抗炎、抗菌活性[6]；同時，鴨嘴花堿被證實能夠有效地降低血壓，而鴨嘴花酮堿具有較強的抗過敏作用[21]，與藏藥鴨嘴花的傳統(tǒng)功效相符。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鴨嘴花的化學成分以生物堿類成分為主，此類成分最能體現(xiàn)其“苦味”藥性，其中鴨嘴花堿被預測為鴨嘴花治療類風濕性關節(jié)炎的潛在標志物，且該成分與鴨嘴花酮堿均在鴨嘴花中具有相對較高的含量[13]，故本研究選擇鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿作為藏藥鴨嘴花的質量評價指標成分。

3.2 色譜條件的確定

本課題組前期對色譜條件進行了系統(tǒng)考察，通過全波長掃描確定了檢測波長，并對比了不同流動相體系（甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）等條件的分離效果，最終確定了適用于鴨嘴花指紋圖譜分析和含量測定的最優(yōu)色譜條件，并通過方法學考察驗證了上述方法的可行性。

3.3 指紋圖譜及化學模式識別分析

本研究從整體性的角度出發(fā)，采用HPLC 指紋圖譜技術結合化學模式識別分析方法對不同來源的11 批鴨嘴花樣品進行評價，結果表明，11 批不同產地的鴨嘴花樣品呈現(xiàn)出較好的相似性。通過建立HPLC指紋圖譜、對比混合對照品圖譜，共確定了23個穩(wěn)定性、分離度皆好的共有峰。通過聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析發(fā)現(xiàn)，這11 批鴨嘴花樣品均可得以明顯區(qū)分。相似的結果提示，上述3種分析方法均可有效區(qū)分不同產地的鴨嘴花藥材。其中，云南產鴨嘴花與西藏產鴨嘴花樣品的品質較為接近，而四川產鴨嘴花與云南、西藏產鴨嘴花樣品則有所區(qū)別；同時，化學模式識別分析結果還提示，產自同一省份的樣品并不完全一致，如同產于云南的S9 樣品與S2～S3、S5～S8 樣品之間存在一定的差異。

從指紋圖譜結果可知，鴨嘴花S9 樣品中21 號峰對應成分的含量明顯高于其他產地的鴨嘴花樣品。通過VIP值分析結果可以看出，21號峰對11批鴨嘴花樣品間的差異有較大的貢獻，結合以上信息可推測21號峰對應成分可能是造成鴨嘴花S9樣品異于其他云南產鴨嘴花樣品的原因。然而，導致鴨嘴花S9 樣品中21 號峰對應成分含量較高的原因可能為該地地理環(huán)境特殊，也可能由取樣誤差所致，具體原因尚有待進一步研究。

為進一步探索造成不同樣品間差異的原因，本研究以VIP值＞1.0為篩選標準，得到了6個色譜峰，即2、16、21、17、1、13號峰，提示其對應的6個成分為影響鴨嘴花質量的差異性成分。通過比對混合對照品溶液的HPLC圖發(fā)現(xiàn)，2號峰為鴨嘴花堿。定量分析結果顯示，該成分與另一含量相對較高的鴨嘴花酮堿（4號峰）的含量分別為4.12～10.22、0.60～3.26 mg/g，該結果表明不同產地的鴨嘴花樣品中上述2種成分的含量存在明顯差異，此差異是否會影響其藥效仍有待進一步實驗證實。從定量結果來看，云南產鴨嘴花樣品中鴨嘴花堿的含量普遍高于四川產鴨嘴花樣品，但與西藏產鴨嘴花樣品相近，提示即使鴨嘴花堿對造成不同樣品間差異的貢獻較大，但僅憑單一成分評價藥材品質具有一定的局限性，有待后續(xù)研究進一步完善。

4 結語

藏藥鴨嘴花現(xiàn)有文獻中關于質量評價方法的研究較少，難以有效為其質量控制提供參考。本研究通過指紋圖譜技術確定了11批藏藥鴨嘴花藥材中的23個共有峰，并結合化學模式識別分析有效地區(qū)分了不同產地的鴨嘴花樣品，直觀地反映了不同產地鴨嘴花藥材的相似性與差異性；進一步通過VIP值篩選出了造成樣品間質量差異的主要成分，為其質量控制提供了參考，也為其后續(xù)研究提供了方向。本研究的不足之處在于樣品收集的數(shù)量有限且未能通過已有文獻鑒定出更多的未知成分。在后續(xù)研究中，本課題組將深入開展鴨嘴花藥材的化學成分研究，重點關注16、21、17、1、13 號峰對應成分的具體結構，并結合藥效學實驗進一步探究這些成分成為鴨嘴花藥材質量標志物的可能性。