基于指紋圖譜和化學(xué)模式識別分析的車前子與炒車前子質(zhì)量評價Δ

何子驥，伍斌璽，李雨昕，沈志濱，劉奇越，王秋紅，#（.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室/黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，哈爾濱 50040；.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣州 5045）

車前子為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥成熟種子[1]，其性寒，味甘，具有清熱利尿通淋、滲濕止渴、明目、祛痰的功效，主要用于治療熱淋濕痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽等[2]。車前子主要含有多糖類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、黃酮類、甾醇及生物堿類等化學(xué)成分[3]，具有利尿、消炎、降血糖、降血壓、調(diào)血脂、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4]。

炒車前子為車前子炒制后的炮制品，除用于便秘的療效顯著外[5]，還可增強清熱利尿、滲濕通淋的功效[6]。目前，關(guān)于炒車前子的研究主要為其炮制工藝優(yōu)化[7－9]，以及以京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量為指標的質(zhì)量標準研究[10]，加之關(guān)于車前子炒制前后整體化學(xué)成分變化以及炒車前子指紋圖譜的研究較少，這使得難以綜合評價車前子炒制前后的整體質(zhì)量和特征成分。

中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘回歸分析等化學(xué)模式識別分析能更加客觀、全面地反映藥材質(zhì)量，已被廣泛用于中藥材的質(zhì)量控制研究[11]。本課題組前期以2020年版《中國藥典》（一部）車前子藥材項下的京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量為指標，對車前子及炒車前子進行含量測定，結(jié)果顯示，車前子中京尼平苷酸的含量為0.51%～1.38%，毛蕊花糖苷的含量為0.67%～1.06%；炒車前子中京尼平苷酸的含量為0.98%～1.47%，毛蕊花糖苷的含量為0.54%～0.94%，均符合藥典規(guī)定[1]?；诖?，本研究在車前子及炒車前子含量符合《中國藥典》規(guī)定的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立了15批車前子與15批炒車前子的指紋圖譜，同時結(jié)合化學(xué)模式識別分析方法比較車前子與炒車前子的質(zhì)量差異，旨在為完善車前子與炒車前子的質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Waters Alliance 型HPLC儀（美國Waters公司），MS105DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），Milli-Q Advantage A10 型臺式純水系統(tǒng)（德國Millipore 公司），C21-WK2102 型多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

京尼平苷酸對照品（批號MB6001-S，純度＞98%）、毛蕊花糖苷對照品（批號MB6742，純度＞98%）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

15 批車前子藥材（編號S1～S15）均于2019 年購自廣州采芝林藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系劉基柱教授鑒定為車前科植物車前P.asiaticaL.的干燥成熟種子。取15 批干凈的車前子藥材（編號S1～S15）適量，置于預(yù)熱電磁爐中，炒至略有爆聲并有香氣逸出時，取出放涼，即得炒車前子（對應(yīng)編號為S16～S30）。15批車前子與15批炒車前子來源信息見表1。

表1 15批車前子與15批炒車前子來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.5%乙酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，5%A；5～15 min，5%A→20%A；15～25 min，20%A→60%A；25～30 min，60%A；30～35 min，60%A→5%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取車前子或炒車前子樣品粉末（過三號篩）1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，加60%甲醇50 mL，精密稱定；連接冷凝管加熱回流提取2 h，放冷，再次精密稱定，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；取續(xù)濾液，于25 ℃以13 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取京尼平苷酸、毛蕊花糖苷對照品各0.1 mg，分別加60%甲醇，制成京尼平苷酸、毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL 的單一對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S11），按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，以京尼平苷酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.37%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.56%～1.62%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S11），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、16、18、24 h 時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以京尼平苷酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.09%～0.41%（n＝8），相對峰面積的RSD 為0.63%～1.95%（n＝8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取車前子（編號S11），共6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以京尼平苷酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～0.41%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.27%～1.75%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 HPLC 指紋圖譜的建立 分別取15 批車前子及15 批炒車前子樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，將得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，采用中位數(shù)法，車前子以S11樣品為對照圖譜，炒車前子以S26 樣品為對照圖譜（因S11、S26 樣品的色譜峰峰形較好），時間窗寬度設(shè)置為0.2，得到15 批車前子及15 批炒車前子的HPLC 疊加指紋圖譜和對照圖譜。結(jié)果顯示，15批車前子有18個共有峰，15批炒車前子有13個共有峰。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，車前子與炒車前子共有8個共有峰，即車前子指紋圖譜中的峰1～峰3、峰6、峰13～峰16，炒車前子指紋圖譜中的峰1～峰3、峰7、峰10～峰13（車前子中的峰6、峰13～峰16 分別與炒車前子中的峰7、峰10～峰13對應(yīng)，為方便后文描述，將對應(yīng)的共有峰依次標記為峰A～峰H）。15批車前子與15批炒車前子的HPLC疊加指紋圖譜見圖1，對照圖譜見圖2。

圖1 15批車前子與15批炒車前子的HPLC疊加指紋圖譜

圖2 車前子與炒車前子的對照圖譜

2.1.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》對15 批車前子及15 批炒車前子進行相似度評價。結(jié)果顯示，30批樣品與對照圖譜的相似度均大于0.920，表明車前子炒制前后的化學(xué)成分種類相似。結(jié)果見表2。

表2 15批車前子與15批炒車前子的相似度評價結(jié)果

2.1.9 共有峰的指認 將車前子及炒車前子的對照圖譜（圖2）與對照品的色譜圖（圖3）進行比較，共指認了2個共有峰，分別為車前子中的峰6（京尼平苷酸）、峰13（毛蕊花糖苷），炒車前子中的峰7（京尼平苷酸）、峰10（毛蕊花糖苷）。由于京尼平苷酸的分離度較好，含量較高，鄰近峰較少，易于區(qū)分，故選擇京尼平苷酸為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，車前子中各共有峰相對保留時間的RSD 為0.08%～0.55%，相對峰面積的RSD為3.86%～44.09%；炒車前子中各共有峰相對保留時間的RSD 為0.08%～0.64%，相對峰面積的RSD 為12.51%～58.61%。各樣品相對保留時間的RSD 差異較小，相對峰面積的RSD差異較大，表明同一品種、不同產(chǎn)地、不同批次車前子炒制前后所含化學(xué)成分的種類具有較高的相似度，但含量存在較大差異。

圖3 京尼平苷酸與毛蕊花糖苷對照品的HPLC圖

2.2 聚類分析

以15批車前子與15批炒車前子共有峰的峰面積為變量進行標準化處理，使用SPSS 25.0軟件，采用質(zhì)心聚類法，以平方歐氏距離為測度進行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)歐氏距離為5時，30批樣品可聚為6類，其中S1為一類，S2～S5 為一類，S6～S15 為一類，S16～S17 為一類，S18～S20 為一類，S21～S30 為一類；當(dāng)歐氏距離為10 時，30 批樣品可聚為3 類，其中S1～S5 為一類，S6～S15、S21～S30為一類，S16～S20為一類；當(dāng)歐氏距離為16 時，30 批樣品可聚為2 類，S1～S5、S16～S20 為一類，S6～S15、S21～S30為一類。結(jié)果見圖4。

圖4 15批車前子與15批炒車前子的聚類分析樹狀圖

2.3 主成分分析

以15批車前子與15批炒車前子共有峰的峰面積為變量，使用SPSS 25.0軟件進行主成分分析。結(jié)果顯示，前2 個主成分的累計方差貢獻率為82.575%，表明前2個主成分可以反映樣品的質(zhì)量。通過碎石圖可知，前2個主成分的曲線陡峭，后面6個主成分的曲線較平緩，表明前2個主成分在車前子及炒車前子中具有重要作用。結(jié)果見表3、圖5。

圖5 車前子與炒車前子的主成分分析碎石圖

表3 8個共有峰的特征值及方差貢獻率

主成分載荷的絕對值越大，表示主成分的變量代表性越大[12]。采用SPSS 25.0 軟件進行主成分因子載荷矩陣。結(jié)果顯示，峰A、峰C、峰E、峰F、峰H在主成分1上具有較高的載荷值，表明這5 個峰對主成分1 的影響較大；峰D、峰G在主成分2上具有較高的載荷值，表明這2個峰對主成分2 的影響較大；峰B 在主成分1、主成分2上的載荷值均不高，表明其對主成分1、主成分2的影響較小。結(jié)果見表4。

表4 車前子與炒車前子的主成分因子載荷矩陣

綜合評分能夠反映樣品的整體質(zhì)量，評分越高表明樣品的整體質(zhì)量越好[13]。采用方差貢獻率計算15 批車前子與15批炒車前子的綜合評分。使用SPSS 25.0軟件得到主成分1（Z1）和主成分2（Z2）的評分分別為Z1＝0.445×峰A－0.326×峰B+0.347×峰C－0.165×峰D－0.433×峰E+0.418×峰F+0.266×峰G－0.339×峰H；Z2＝0.081×峰A－0.378×峰B+0.062×峰C+0.631×峰D+0.199×峰E－0.029×峰F+0.532×峰G+0.356×峰H。其中，峰A～峰H 為共有峰的峰面積，Z1、Z2的系數(shù)為主成分1、2的載荷值與特征值開平方的比值，按公式計算綜合評分（Z），Z＝Z1×主成分1的方差貢獻率+Z2×主成分2的方差貢獻率。結(jié)果顯示，車前子的綜合評分均小于0，炒車前子的綜合評分均大于0（S24樣品除外），表明綜合評分可以較好地區(qū)分車前子與炒車前子。結(jié)果見表5。

表5 15 批車前子與15 批炒車前子的綜合評分結(jié)果及排序

2.4 正交偏最小二乘回歸分析

以15批車前子與15批炒車前子共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA-P 14.1軟件進行正交偏最小二乘回歸分析。結(jié)果顯示，車前子均位于得分圖的左側(cè)，炒車前子均位于得分圖的右側(cè)，二者能明顯分開。模型累計解釋能力參數(shù)R2X（cum）為0.991，R2Y（cum）為0.965，模型預(yù)測度Q2（cum）為0.942，均大于0.500，表明模型構(gòu)建成功，預(yù)測能力較強，擬合度好[14]。結(jié)果見圖6。

圖6 15 批車前子與15 批炒車前子的正交偏最小二乘回歸分析得分圖

當(dāng)變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值大于1 時，表示變量對整體的貢獻較大[15]，故以VIP 值大于1 為標準，得到貢獻相對較大的3個峰，分別為峰E（毛蕊花糖苷）、峰D（京尼平苷酸）、峰G，表明這3個峰對車前子與炒車前子的貢獻較大，推測其可能是影響車前子與炒車前子質(zhì)量差異的標志性成分。變量的點距離原點的距離越遠，表示變量對模型的影響越大[16]。結(jié)果顯示，峰E、峰D、峰G 對車前子與炒車前子的影響較大。結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 8個共有峰的VIP值

圖8 15 批車前子與15 批炒車前子的正交偏最小二乘回歸分析載荷圖

3 討論

本課題組前期分別對不同流動相（甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液）、不同流速（0.5、1.0 mL/min）、洗脫時間（35、45、55 min）、柱溫（30、35 ℃）等進行考察。結(jié)果顯示，采用本研究所用的色譜條件時，各色譜峰均能較好地分離，基線相對平穩(wěn)。

指紋圖譜結(jié)果顯示，15批車前子有18個共有峰，炒車前子有13個共有峰，車前子與炒車前子共有8個共有峰，共指認了2 個共有峰，分別為車前子中的峰6（京尼平苷酸）、峰13（毛蕊花糖苷），炒車前子中的峰7（京尼平苷酸）、峰10（毛蕊花糖苷）。15批車前子與對照圖譜的相似度均大于0.980，15 批炒車前子與對照圖譜的相似度均大于0.920，相似度較高，表明不同產(chǎn)地車前子、炒車前子的化學(xué)成分種類相似，具有較好的一致性。

聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)歐氏距離為10時，30批樣品可聚為3類，其中S1～S5為一類，S6～S15、S21～S30為一類，S16～S20 為一類；當(dāng)歐氏距離為16 時，30 批樣品可聚為2 類，S1～S5、S16～S20 為一類，S6～S15、S21～S30 為一類，表明江西省和山東省產(chǎn)車前子有一定的相似性，能與湖北省產(chǎn)車前子區(qū)分開。主成分分析結(jié)果顯示，前2個主成分的累計方差貢獻率為82.575%，車前子的綜合評分均小于0，炒車前子的綜合評分均大于0（S24 樣品除外），表明炒車前子的整體質(zhì)量較好。正交偏最小二乘回歸分析結(jié)果顯示，峰E（毛蕊花糖苷）、峰D（京尼平苷酸）和峰G 可能是影響車前子與炒車前子質(zhì)量差異的標志性成分，其可能與地理環(huán)境、氣候條件、種植模式、采收期等有關(guān)。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜穩(wěn)定、簡便快速，結(jié)合化學(xué)模式識別分析可用于評價車前子與炒車前子的質(zhì)量。毛蕊花糖苷、京尼平苷酸和峰G所代表的成分可能是影響車前子與炒車前子質(zhì)量差異的標志性成分。