HPLC-QqQ-MS法同時(shí)測(cè)定八味小檗皮膠囊中25種成分的含量Δ

易 歡，彭 芳，謝雨宸，茍曉玲，丁 銀，范 剛#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 637；.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都 637）

八味小檗皮膠囊為常用的藏藥復(fù)方制劑，由小檗皮、蓽茇、紅花、余甘子、甘草、熊膽粉、人工麝香、京墨8味藥組成，具有消炎止痛、固精止血的功效，臨床上常用于治療尿路感染、尿痛、白濁、血尿、滑精等疾病。八味小檗皮膠囊處方來(lái)源于八味小檗皮散，《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥分冊(cè)》對(duì)八味小檗皮散的制法、性狀、檢查等進(jìn)行了描述[1]，但無(wú)鑒別、含量測(cè)定等內(nèi)容，難以進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。目前，雖已有文獻(xiàn)采用高效液相色譜法測(cè)定了八味小檗皮散中沒(méi)食子酸和小檗堿的含量[2－3]和八味小檗皮膠囊中鹽酸小檗堿的含量[4]，但由于該藥成分復(fù)雜，且復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，加之羥基紅花黃色素A、甘草苷、鞣花酸、熊去氧膽酸、膽酸等成分已被證明具有明顯的抗炎、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等活性[5－8]。因此，建立多成分的含量測(cè)定方法有利于控制八味小檗皮膠囊的生產(chǎn)投料和內(nèi)在質(zhì)量，也可為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、分析范圍廣等特點(diǎn)，可對(duì)藥材中的微量成分或不易分離的成分進(jìn)行定性定量分析[9－10]。本研究充分利用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（high-performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-QqQ-MS）技術(shù)的分析優(yōu)勢(shì)，首次對(duì)藏藥八味小檗皮膠囊中的25種成分（均為8味藥的活性成分）進(jìn)行了定量測(cè)定，旨在為其成分分析提供方法學(xué)參考，也為今后探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260 型HPLC 儀、G6420A型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司），Sartorius CPA225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，CQ-250 型超聲清洗器[必能信超聲（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)100081-200907）、膽酸對(duì)照品（批號(hào)100078-200414）、藥根堿對(duì)照品（批號(hào)110733-201108）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)080-9303）、柯里拉京對(duì)照品（批號(hào)111623-200302）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)0773-9910）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)MUST-13040103）購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；甘氨膽酸對(duì)照品（批號(hào)G131002）、甘氨脫氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)G113438）、甘氨鵝脫氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)S167765）均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熊去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)DST200823-076）、胡椒堿對(duì)照品（批號(hào)DST200109-043）、甘草酸對(duì)照品（批號(hào)DSTDG000601）、訶子鞣酸對(duì)照品（批號(hào)DST200927-064）、甘草素對(duì)照品（批號(hào)DSTDG001001）、蟾蜍色胺對(duì)照品（批號(hào)DST201022-175）均購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司；木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)PS170717-08）、鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)PS010827）、羥基紅花黃色素A 對(duì)照品（批號(hào)PS000745）均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司；甘草苷對(duì)照品（批號(hào)G-009-121124）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)RFS-L00701908029）均購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)H-015-150808）、小檗堿對(duì)照品（批號(hào)Y-035-150818）均購(gòu)于四川賽因斯特生物科技有限公司；阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和蟾蜍特尼定對(duì)照品均為本課題組自制[11]。所有對(duì)照品純度均大于96.0%。色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；色譜級(jí)甲酸購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；色譜級(jí)醋酸銨購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。3 批八味小檗皮膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025870，批號(hào)分別為20190502、20210617、20211125，規(guī)格0.3 g/粒）均購(gòu)于青海久美藏藥藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得各單一對(duì)照品母液。量取各單一對(duì)照品母液適量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，即得木蘭花堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、胡椒堿、甘草酸、阿魏酸、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、綠原酸、沒(méi)食子酸、訶子鞣酸、柯里拉京、鞣花酸、甘草素、甘草苷、蘆丁、槲皮素、甘氨膽酸、膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、熊去氧膽酸質(zhì)量濃度分別為110 000.00、91 000.00、110 437.50、8 150.00、2 700.00、21 093.75、9 720.00、18 000.00、3 019.50、61 000.00、11 900.00、3 180.00、61 500.00、56 700.00、9 900.00、21 200.00、900.90、2 484.00、487.50、342.00、5 340.00、3 040.00、300.00、3 030.00、318.00 ng/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取八味小檗皮膠囊內(nèi)容物約0.1 g，精密稱定，置于50 mL 錐形瓶中，加入70%甲醇35 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min，待冷卻后，稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 以WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0.01～1.00 min，10%B→45%B；1.00～3.00 min，45%B→70%B；3.00～4.00 min，70%B；4.00～5.00 min，70%B→75%B；5.00～7.00 min，75%B；7.00～10.00 min，75%B→95%B；10.00～20.00 min，95%B）；柱溫為25 ℃；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正、負(fù)離子模式下選擇多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式測(cè)定各成分含量；毛細(xì)管電壓分別為4 000 V（+）、2 500 V（－）；干燥氣為氮?dú)?，干燥氣流速?1 L/min，溫度為300 ℃，壓力為15 psi；碰撞氣為高純氮?dú)?。詳?xì)的質(zhì)譜參數(shù)信息見表1。

表1 25種成分的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取“2.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品母液及供試品溶液（批號(hào)20190502），以70%甲醇作為空白溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白溶液對(duì)所測(cè)成分無(wú)干擾，且供試品溶液中25種成分的出峰時(shí)間與對(duì)照品溶液中的基本一致，說(shuō)明該方法專屬性較好。木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等8 種成分的MRM 色譜圖見圖1（其余成分的MRM色譜圖略去）。

圖1 木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等8種成分的MRM色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察及定量限、檢測(cè)限測(cè)定 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋成系列工作溶液。取上述系列工作溶液和混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。以峰高信號(hào)為基線噪音信號(hào)的10 倍測(cè)定定量限，以峰高信號(hào)為基線噪音信號(hào)的3倍測(cè)定檢測(cè)限。結(jié)果見表2。

表2 25 種成分的回歸方程、線性范圍、定量限、檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn) 稱取八味小檗皮膠囊內(nèi)容物（批號(hào)20190502），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件于同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分峰面積的RSD均小于3.00%（n＝6），說(shuō)明儀器精密度較好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取八味小檗皮膠囊內(nèi)容物（批號(hào)20190502），共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分含量的RSD均小于3.00%（n＝6），說(shuō)明方法重復(fù)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取八味小檗皮膠囊內(nèi)容物（批號(hào)20190502），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h 后按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分峰面積的RSD均小于3.00%（n＝7），說(shuō)明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的八味小檗皮膠囊內(nèi)容物（批號(hào)20190502），共6 份，每份約0.05 g，精密稱定，按已知含量的100%加入各單一對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分的加樣回收率均在80%～115%之間，RSD均小于3.00%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批八味小檗皮膠囊內(nèi)容物約0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各批樣品平行制備3 份，按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，木蘭花堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、胡椒堿、甘草酸、阿魏酸、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、綠原酸、沒(méi)食子酸、訶子鞣酸、柯里拉京、鞣花酸、甘草素、甘草苷、蘆丁、槲皮素、甘氨膽酸、膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、熊去氧膽酸的含量分別為16.94～20.82、3.78～5.17、9.11～11.43、0.24～0.30、0.20～0.39、0.74～1.16、0.79～0.89、3.26～3.35、0.48～0.66、11.96～13.35、2.30～3.12、0.19～0.21、6.07～8.83、10.42～10.48、1.43～1.64、4.17～4.76、0.14～0.15、0.46～0.52、0.04、0.01、0.59～0.63、0.20～0.23、0.02、0.15～0.16、0.01 mg/g。結(jié)果見表3。

表3 八味小檗皮膠囊中25 種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

目前，僅有文獻(xiàn)采用HPLC 法測(cè)定了八味小檗皮制劑中小檗堿和沒(méi)食子酸的含量[2－4]，但由于復(fù)方制劑的成分復(fù)雜，僅以1 個(gè)或2 個(gè)成分進(jìn)行成分分析不具有代表性。本課題組前期曾嘗試采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定八味小檗皮膠囊中的多種成分，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分成分都難以得到有效分離，故本研究充分利用HPLC-QqQMS技術(shù)的方法學(xué)優(yōu)勢(shì)對(duì)多種成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。通過(guò)對(duì)正、負(fù)離子模式的探索發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，木蘭花堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、胡椒堿、甘草酸的響應(yīng)值較高，而阿魏酸、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、柯里拉京、甘草素、甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸等其他17種成分在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值較高。在此基礎(chǔ)上，還對(duì)各成分的碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了本研究采用的質(zhì)譜參數(shù)。

3.2 色譜條件的考察

本課題組前期分別考察了CAPCELL PAK（4.6 mm×250 mm，5 μm）和WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱時(shí)，各色譜峰的峰形、分離度均較好。同時(shí)考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L 醋酸銨溶液、甲醇-水（含0.1%甲酸和5 mmol/L醋酸銨）、乙腈-0.1%甲酸溶液5個(gè)流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜峰的峰形較好、響應(yīng)值較高。此外，還考察了不同柱溫（25、30、35 ℃），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3種柱溫條件下，所得色譜峰的峰面積及峰形相差不大。綜合各因素，最終確定了本研究采用的色譜條件。

3.3 提取條件的考察

本課題組前期分別考察了冷浸、回流和超聲3 種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取更加簡(jiǎn)便、易行，且大部分成分的提取效率較高。此外，還考察了提取溶劑（20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、超聲時(shí)間（15、30、45、60 min）和提取溶劑用量（15、25、35、45 mL），根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果綜合分析，最終確定了本研究采用的供試品溶液制備方法。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

根據(jù)3 批樣品的含量測(cè)定結(jié)果可知，八味小檗皮膠囊中木蘭花堿、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、小檗堿、訶子鞣酸等成分的含量較高，而槲皮素、熊去氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸等成分的含量較低。

綜上所述，八味小檗皮膠囊含有多種藏藥材，化學(xué)成分復(fù)雜多樣，相互之間干擾較大，采用常規(guī)的HPLC法難以進(jìn)行多成分的定量分析。本研究采用HPLCQqQ-MS技術(shù)首次測(cè)定了八味小檗皮膠囊中小檗堿、木蘭花堿、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、柯里拉京等25種成分的含量（建立了甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸等無(wú)紫外吸收的膽汁酸類成分的含量測(cè)定方法）。本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低、分析時(shí)間短、穩(wěn)定性好，可同時(shí)對(duì)八味小檗皮膠囊中多種有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。