復(fù)合酶法油莎豆多孔淀粉的制備及其性質(zhì)研究

包尕紅，司美雙，吳修利

（長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

油莎豆（Cyperus esculentus L.）屬莎草科一年生植物，原產(chǎn)地是非洲及地中海沿岸國(guó)家，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，在我國(guó)南北各地的沙灘、丘陵、崗地等均有大量種植[1]。油莎豆可食塊莖中脂肪含量21%～25%，淀粉含量高達(dá)26%～30%[2]，在老化和凍融穩(wěn)定性方面，油莎豆淀粉優(yōu)于馬鈴薯或玉米淀粉[3]，因此，具有很大的潛在開發(fā)價(jià)值。

近年來(lái)，對(duì)于油莎豆的研究主要集中在油脂特性等方面，而對(duì)油莎豆淀粉的研究主要是提取工藝的優(yōu)化和理化性質(zhì)分析。王璐陽(yáng)等[4]對(duì)脫皮油莎豆壓榨餅提取淀粉的研究表明，油莎豆淀粉的顆粒大小、分布比較均勻，且凝膠質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于玉米淀粉。于淑艷等[5]研究發(fā)現(xiàn)，油莎豆淀粉具有較低的透明度、溶解度和膨脹度，但其凍融穩(wěn)定性和老化性優(yōu)于玉米淀粉，藍(lán)值也顯著高于馬鈴薯淀粉。目前，有關(guān)以油莎豆淀粉為原料制備多孔淀粉的探索研究報(bào)道較少，張鐵華等[6]發(fā)明了一種高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶法制備油莎豆多孔淀粉的方法，以高壓脈沖電場(chǎng)作為酶解預(yù)處理方式，使用糖化酶水解油莎豆淀粉，得到孔徑小、吸附力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣的油莎豆多孔淀粉。

目前為止，多孔淀粉的制備方法主要包括物理、化學(xué)、酶和協(xié)同法。酶法具有反應(yīng)條件溫和，催化效率和底物特異性高等優(yōu)點(diǎn)，常被選擇用來(lái)進(jìn)行多孔淀粉的制備[7-8]。本試驗(yàn)以油莎豆淀粉為原料，采用復(fù)合酶法對(duì)油莎豆淀粉進(jìn)行改性處理制備多孔淀粉，復(fù)合酶可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，能夠更好地促進(jìn)淀粉表面和內(nèi)部發(fā)生水解，形成更多的孔隙結(jié)構(gòu)，為油莎豆淀粉的深加工產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆淀粉：長(zhǎng)春大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室制；大豆油（食品級(jí)）：九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；α-淀粉酶（10 000 U/g）、葡萄糖淀粉酶（100 000 U/mL）、磷酸氫二鈉（分析純）、檸檬酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、溴化鉀（光譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（50 U/mg）、糖化酶（100 000 U/g）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；氫氧化鉀、冰醋酸、無(wú)水乙酸鈉、3，5-二硝基水楊酸（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H-1850R）：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；掃描電子顯微鏡（S-3400N）：日本Hitachi公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS5）：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；質(zhì)構(gòu)儀（EZ-SX）：日本島津公司；快速黏度分析儀（3JK-1）：澳大利亞Perten公司。

1.3 方法

1.3.1 多孔淀粉的制備

稱取20.0 g油莎豆原淀粉于250 mL錐形瓶中，加入pH值為4.73的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液60 mL，置于50℃恒溫水浴鍋中攪拌預(yù)熱10min，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%加入復(fù)合酶，α-淀粉酶與糖化酶質(zhì)量比1∶5，于50℃恒溫培養(yǎng)搖床中（120 r/min）反應(yīng)10 h后加入5mL的4%氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，將懸浮液3000r/min離心10 min，去掉上清液，沉淀水洗3次，最后用乙醇洗1次，在50℃烘箱干燥24 h，研磨后過孔徑0.150 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，得油莎豆多孔淀粉[9]。

1.3.2 吸油率、吸水率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉各1.0 g（m1），置于已知質(zhì)量的15 mL離心管中，恒溫下與10 mL的大豆油或去離子水混合攪拌30 min，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，倒掉上層液體（油或水），直至無(wú)油滴或水滴滴下，稱取離心管的質(zhì)量。根據(jù)式（1）計(jì)算吸油率（ω）。

式中：m1為淀粉樣品質(zhì)量，g；m2為離心后管與樣品的總質(zhì)量，g；m0為離心管質(zhì)量，g。

1.3.3 淀粉比容積的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.0 g淀粉于10 mL量筒中，使淀粉自由落下，晃動(dòng)量筒保持淀粉面水平，讀數(shù)，計(jì)算每克淀粉所占的體積，即為淀粉的比容積[10]。

1.3.4 抗性淀粉含量的測(cè)定

根據(jù)McCleary法[11]測(cè)定抗性淀粉含量，準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品于離心管中，加入4.0 mL豬胰α-淀粉酶和糖化酶混合液，渦旋混勻，水平放置于恒溫振蕩器中，在37℃、200 r/min處理16 h。取出離心管，加入4 mL無(wú)水乙醇，渦旋混勻，3 500 r/min離心10 min，倒出上清液。加2 mL 50%乙醇，漩渦混勻，再加6 mL 50%乙醇，3 500 r/min離心10 min，倒出上清液，重復(fù)此步驟。漩渦混勻后加2 mL 2 mol/L的KOH溶液，將沉淀冰浴20 min。然后加入8 mL醋酸鈉緩沖液（pH3.8），并立即加入0.1 mL糖化酶酶液，50℃水浴30 min，期間間歇混勻。處理后的溶液3 500 r/min離心10 min。

吸取0.1 mL待測(cè)液于25 mL比色管中，加入1 mL蒸餾水和5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，沸水浴5 min后，迅速流水冷卻，并定容至25 mL，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光值。采用DNS法測(cè)葡萄糖含量，抗性淀粉（resistant starch，RS）含量按式（2）計(jì)算。

式中：G為葡萄糖含量，mg；V為吸取的待測(cè)液體積，mL；M為待測(cè)樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 掃描電子顯微鏡

將樣品均勻地撒在樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，噴金后置于電子顯微鏡樣品室中，在15 kV的加速電壓下對(duì)樣品放大10 000倍進(jìn)行觀察，并選取有代表性的圖片拍照[12]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜

采用溴化鉀壓片法，在波數(shù)4 000 cm-1～400 cm-1，以4 cm-1的分辨率繪制樣品的紅外光譜。

1.3.7 黏度測(cè)定

使用快速黏度分析儀（rapid visco analysis，RVA）測(cè)定樣品糊化特性[13]。取2.5 g淀粉樣品（校正為12%水分基準(zhǔn)）加入18.5 mL蒸餾水中，并在RVA樣品鋁罐中攪拌。升溫-降溫循環(huán)：加熱至50℃并保持1 min，以12℃/min在3.75 min內(nèi)升溫至95℃，在95℃下保持2.5 min，然后在3.75 min內(nèi)冷卻至50℃，并保持100 s。在測(cè)量過程中，槳葉轉(zhuǎn)速設(shè)置為160 r/min。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

參考劉佳等[14]的方法并加以改動(dòng)，將糊化后的油莎豆淀粉在室溫條件下冷卻，密封，4℃條件下冷藏24 h，用于質(zhì)構(gòu)測(cè)定。測(cè)試條件：TPA模式，P 0.5探頭，探頭下行速度模式為測(cè)試前速率1.0 mm/s，測(cè)試速率1.0 mm/s，測(cè)試后速率1.0 mm/s；壓縮變形為樣品高度的40%；觸發(fā)值5 g。觀察凝膠硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性和咀嚼性能的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

作圖和數(shù)據(jù)處理與分析使用Origin 2019b和SPSS 22.0軟件進(jìn)行，試驗(yàn)3次重復(fù)取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆原淀粉與多孔淀粉的性質(zhì)比較

對(duì)油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 油莎豆原淀粉與多孔淀粉的性質(zhì)比較Table 1 Comparison of the properties of original starch and porous starch of Cyperus esculentus

從表1可知，油莎豆多孔淀粉樣品吸油和吸水率顯著提升，吸油率和吸水率提升至原淀粉的2倍多；吸水率和吸油率可以在一定程度上反映多孔淀粉的成孔情況，隨著部分油莎豆結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得多孔淀粉孔洞增多，比表面積增大，吸附性能得到明顯提高。油莎豆多孔淀粉的比容積為3.40 g/cm3，近似為原淀粉的2倍，這是因?yàn)樵谕荣|(zhì)量下，由于多孔淀粉內(nèi)部中空結(jié)構(gòu)的形成，體積相比于原淀粉變大，使得比容積也發(fā)生明顯改變。有些淀粉天然具有抗消化性，油莎豆原淀粉抗性淀粉含量24.82%，經(jīng)復(fù)合酶法處理后降低為17.30%，王金花等[15]采用α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶處理玉米淀粉，在不同酶解時(shí)間下，抗性淀粉含量相比于玉米原淀粉也呈下降趨勢(shì)。

2.2 掃描電子顯微鏡分析

對(duì)油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉進(jìn)行掃描電鏡分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 油莎豆原淀粉及其多孔淀粉電鏡圖Fig.1 SEM images of original starch and porous starch of Cyperus esculentus

由圖1a可知，油莎豆原淀粉呈球形或橢圓形，表面光滑且圓潤(rùn)。圖1b顯示，經(jīng)雙酶法處理制備的油莎豆多孔淀粉表面產(chǎn)生了少量不均勻、大小不一的孔洞，比表面積增大。將兩種不同類型的酶結(jié)合在一起使用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高孔隙形成的效率，α-淀粉酶能有效地水解α，1-4糖苷鍵，這是非晶態(tài)區(qū)的主要結(jié)構(gòu)，且α-淀粉酶和糖化酶兩者都能提供內(nèi)切和外切效應(yīng)[8]。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

為了研究酶解對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜分析，油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉的紅外光譜如圖2所示。

圖2 油莎豆原淀粉及其多孔淀粉紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of original starch and porous starch of Cyperus esculentus

由圖2可知，酶促反應(yīng)后，油莎豆多孔淀粉基本分子結(jié)構(gòu)保持不變，光譜帶最大值沒有偏移。油莎豆原淀粉的FT-IR光譜特征吸收峰在3 439 cm-1處出現(xiàn)—OH振動(dòng)形成的吸收峰，在2 921、1 415 cm-1處的特征峰分別歸屬于—CH2的伸縮振動(dòng)和變形振動(dòng)，在1643cm-1處的特征峰歸屬于C—O—O的伸縮振動(dòng)峰，在1 156 cm-1處的特征峰歸屬于C—C，C—O的伸縮振動(dòng)峰，在1 081cm-1處的特征峰歸屬于C—O—H的伸縮振動(dòng)峰[16]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雙酶法制備的油莎豆多孔淀粉光譜與原淀粉相似，特征吸收峰無(wú)明顯差異，證明酶解并未改變淀粉的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.4 RVA黏度分析

油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉的糊化參數(shù)如表2所示。

表2 油莎豆原淀粉及其多孔淀粉的糊化特性參數(shù)Table 2 Gelatinization characteristic parameters of original starch and porous starch of Cyperus esculentus

淀粉顆粒在加熱過程中受熱膨脹，從而導(dǎo)致淀粉懸浮液黏度增加，然后淀粉顆粒發(fā)生膨脹破裂，黏度也因此下降。由表2中數(shù)據(jù)可知，油莎豆多孔淀粉的峰值黏度和谷值黏度均低于油莎豆原淀粉，這可能是由于淀粉的無(wú)定形區(qū)發(fā)生酶解，使得淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)被削弱。多孔淀粉在糊化過程中溶脹不能達(dá)到最大，導(dǎo)致其黏度下降[17]。崩解值反映了淀粉的耐剪切性能，崩解值越大耐剪切能力越差，油莎豆多孔淀粉崩解值較油莎豆原淀粉降低?；厣蹬c淀粉在冷卻過程中的重結(jié)晶和重排有關(guān)[18]，油莎豆多孔淀粉的回升值低于油莎豆原淀粉，表明多孔淀粉相比于原淀粉不易老化。

2.5 油莎豆淀粉凝膠質(zhì)構(gòu)分析

淀粉的凝膠質(zhì)構(gòu)特性通常與富含淀粉類食品的加工品質(zhì)和速食性能有直接關(guān)系，因?yàn)榈矸酆笮纬砂胪该髂z，凝膠的黏彈性和強(qiáng)度會(huì)發(fā)生一定程度的改變[19]，油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)結(jié)果如表3所示。

表3 二次壓縮模式測(cè)定參數(shù)值Table 3 Parameters by texture profile analysis

由表3可知，油莎豆多孔淀粉的硬度、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性指標(biāo)均明顯高于油莎豆原淀粉，說(shuō)明油莎豆多孔淀粉的凝膠質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于原淀粉；而其彈性數(shù)值略有下降，凝膠彈性大小顯示出對(duì)外界破壞抵抗能力的強(qiáng)弱，油莎豆原淀粉和油莎豆多孔淀粉經(jīng)糊化后形成半透明凝膠，淀粉分子的部分鏈段會(huì)發(fā)生位移產(chǎn)生黏性流動(dòng)，而黏性流動(dòng)一定程度上會(huì)影響到淀粉凝膠的彈性性質(zhì)[20]。

3 結(jié)論

以油莎豆原淀粉為原料，采用復(fù)合酶法制備油莎豆多孔淀粉。結(jié)果表明，油莎豆多孔淀粉的吸油率、吸水率和比容積增大為油莎豆原淀粉的2倍左右，糊化后抗性淀粉含量降低，油莎豆多孔淀粉表面產(chǎn)生部分新的孔洞。油莎豆多孔淀粉與油莎豆原淀粉相比，峰值黏度、谷值黏度和終值黏度降低，峰值時(shí)間增長(zhǎng)，硬度、內(nèi)聚性、膠黏性和咀嚼性增大。試驗(yàn)結(jié)果為油莎豆淀粉的改性提供了理論基礎(chǔ)。