響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助酶法提取油莎豆ACE抑制肽的工藝

殷海洋，劉振春，張世康，安 琪

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

油莎豆（Cyperus esculentus）因細(xì)長(zhǎng)的根系頂端長(zhǎng)有形狀似豆的塊莖而得名，屬禾本科一年生植物，原產(chǎn)于非洲及地中海沿岸國(guó)家。油莎豆擁有極強(qiáng)的適應(yīng)生存能力，于1960年被我國(guó)引進(jìn)并大面積種植，主要分布于黑龍江、北京、河北、湖南、山東、四川等地[1?2]。油莎豆的主要成分是油脂及淀粉，占比達(dá)55%，此外還含有約10%的蛋白質(zhì)。油莎豆蛋白中含17 種氨基酸，營(yíng)養(yǎng)極為豐富且消化率極高，其中70.59%的蛋白可被胃蛋白酶直接消化吸收，是一種利用價(jià)值超過小麥、玉米的高價(jià)值糧食作物[3?6]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是一種對(duì)血壓有升高作用的酶，主要存在于動(dòng)物肺部組織。ACE 可通過催化血管緊張素I 轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，促進(jìn)血管收縮引起血壓升高[7?8]，還可使人體內(nèi)舒緩肌肽失活，阻礙血管舒張，從而使血壓升高。而ACE 抑制肽是一種可以有效抑制ACE 生理活動(dòng)、降低血壓的多肽物質(zhì)，它與ACE 間存在極強(qiáng)的相互作用，可以限制血管緊張素I 向血管緊張素II 轉(zhuǎn)化[9?12]。近年來有很多研究者從核桃、綠豆等植物中提取ACE 抑制肽并用于治療高血壓，都表現(xiàn)出明顯的效果[13?15]。

我國(guó)對(duì)油莎豆ACE 抑制肽的制備和研究處于起步階段，主要集中在研究油莎豆的種植和成分分析。利用超聲波輔酶法提取油莎豆ACE 抑制肽未見報(bào)道，對(duì)油莎豆的利用和開發(fā)有重要意義[16]。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶法提取油莎豆ACE 抑制肽工藝，以期為油莎豆ACE 抑制肽進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油莎豆 吉林農(nóng)大外農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)售；堿性蛋白酶（100 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg）、胃蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（100 U/mg） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL） Sigma 公司。

JY99-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LG0.2 真空冷凍干燥機(jī) 沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；LXJ-ⅡB 離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHA-B 水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠；SPD-20A UVmini-1240 紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油莎豆蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 將霉變和有蟲洞的油莎豆篩除后粉碎、用石油醚浸泡脫脂、干燥過80 目篩。稱取油莎豆粉20 g，按1:15（g/mL）加入蒸餾水混合，45 ℃水浴。用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 為9.0，攪拌1 h，5000 r/min 離心10 min 后，將上清液均分成6 組。用1 mol/L HCl 溶液將上述6 組上清液pH 分別調(diào)為3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8，靜置30 min 后5000 r/min 離心10 min，取沉淀物稱重，以沉淀質(zhì)量最大值時(shí)的pH 為油莎豆蛋白等電點(diǎn)[17]。

1.2.2 ACE 抑制率測(cè)定 采用Cushman 檢測(cè)方法[18]，在4 mL EP 管中先加入200 μL 馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）溶液，再加入50 μL ACE 抑制劑，混合后置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴5 min，然后再加入50 μL ACE 溶液。37 ℃水浴條件下保持40 min，將1 moL/L HCl 溶液作為終止劑，向上述溶液中加入200 μL HCl 溶液迅速降低pH 終止反應(yīng)。再向試管中加入1.2 mL 乙酸乙酯搖勻混合約15 s，5000 r/min 離心10 min 吸取0.8 mL 脂層溶液，120 ℃烘干30 min。烘干后白色晶體加入3 mL 的去離子水溶解，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為228 nm 處吸光值。

ACE 抑制率測(cè)定步驟見表1，計(jì)算公式如下：

表1 ACE 抑制率的測(cè)定步驟Table 1 Determination of ACE inhibition rate

式中：A1：ACE 抑制肽和ACE 都存在的溶液吸光度值；A2：不加ACE 抑制肽的溶液吸光度值；A3：ACE 與HHL 存在的空白溶液吸光度值。

1.2.3 油莎豆蛋白質(zhì)提取 將霉變和有蟲洞的油莎豆篩除后粉碎、用石油醚浸泡脫脂、干燥過80 目篩。按1:15 （g/mL）加入蒸餾水混合均勻，用0.5 mol/L NaOH 將pH 調(diào)至9.0 攪拌提取1 h，5000 r/min 離心10 min，取上清液。再將上清液用0.5 mol/L HCl滴定至等電點(diǎn)（pH4.2），靜置30 min 后5000 r/min 離心10 min，沉淀用蒸餾水反復(fù)洗至中性，冷凍干燥48 h。密封在?20 ℃冰箱中保存[19]。

1.2.4 超聲波輔助酶法制備油莎豆ACE 抑制肽工藝 取5 g 油莎豆粗蛋白，按料液比1:10 加入蒸餾水。180 W 超聲處理20 min，用0.5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 到9，水浴至恒溫45 ℃后加入5000 U/g 的蛋白酶，酶解3 h。將溫度提升至90 ℃維持15 min 滅酶，冷卻至室溫再將酶解液pH 調(diào)至等電點(diǎn)（4.2），5000 r/min 離心20 min，取上清液冷凍干燥[20]。

1.2.5 蛋白酶的篩選 油莎豆粗蛋白為底物，選取中性蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶4 種酶在最適條件下對(duì)油莎豆粗蛋白進(jìn)行酶解[21]。底物濃度3%，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間3 h。將溫度提升至90 ℃維持15 min 滅酶，冷卻至室溫再將酶解液pH 調(diào)至等電點(diǎn)（4.2），5000 r/min 離心20 min，收集上清液，測(cè)其ACE 抑制率。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 底物濃度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響制備底物濃度為1%、2%、3%、4%、5%（m/v）的油莎豆粗蛋白溶液。180 W 超聲處理20 min，將pH 調(diào)至9，酶解溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間3 h。測(cè)定底物濃度對(duì)酶解液ACE 抑制率的影響。

1.2.6.2 超聲處理時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質(zhì)溶液，超聲功率180 W，將超聲處理時(shí)間設(shè)定為10、15、20、25、30 min。將pH 調(diào)至9，酶解溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間3 h。測(cè)定超聲處理時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.3 超聲功率對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質(zhì)溶液,分別在超聲功率為0、60、120、180、240 W，超聲處理20 min。將pH 調(diào)至9，水浴溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間3 h。測(cè)定超聲功率對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.4 酶解溫度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質(zhì)溶液，180 W 超聲處理20 min。將pH 調(diào)至9，分別設(shè)定酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間3 h。測(cè)定酶解溫度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.5 酶解時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質(zhì)溶液，180 W 超聲處理20 min。將pH 調(diào)至9，酶解溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間分別選取為1、2、3、4、5 h。測(cè)定酶解時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.6 加酶量對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質(zhì)溶液，180 W 超聲處理20 min。將pH 調(diào)至9，酶解溫度45 ℃，加酶量分別選取為3000、4000、5000、6000、7000 U/g，酶解時(shí)間3 h。測(cè)定加酶量對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以油莎豆ACE 抑制率為響應(yīng)變量，從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選取3 個(gè)對(duì)油莎豆ACE 抑制率影響最大的因素，見表2。以ACE 抑制率為指標(biāo)優(yōu)化酶解溫度、超聲功率、酶解時(shí)間。

表2 響應(yīng)面分析因素及水平Table 2 Response surface analysis factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，取平均值。單因素實(shí)驗(yàn)采用Origin2018 軟件繪圖，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示；采用Design Expert8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆蛋白等電點(diǎn)的確定

油莎豆等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果如圖1所示，在pH3.8～4.2 時(shí)，蛋白質(zhì)得率增加；在pH4.2～4.8 時(shí)，蛋白質(zhì)得率降低，因此提取油莎豆蛋白最佳pH 為4.2。

圖1 油莎豆蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定Fig.1 Determination of the isoelectric point of Cyperus esculentus protein

2.2 蛋白酶的選擇

選用4 種蛋白酶對(duì)油莎豆蛋白進(jìn)行酶解，測(cè)定其抑制率，結(jié)果如表3所示。其中堿性蛋白酶的ACE 抑制率最高，為74.45%，因此堿性蛋白酶為油莎豆粗蛋白最適酶解用酶。

表3 四種蛋白酶對(duì)油莎豆ACE 抑制肽的抑制率的影響Table 3 Influence of four proteases on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE inhibitor peptide

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 底物濃度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖2可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為1%～3%時(shí)，ACE 抑制率隨著底物濃度的增加而增加；底物濃度為3%時(shí)ACE 抑制率達(dá)到最大值74.29%；底物濃度超過3%時(shí)，ACE 抑制率開始降低。底物濃度的多少直接決定了ACE 抑制肽的含量，從而影響了ACE 與ACE 抑制肽間相互作用機(jī)率的大小及傳質(zhì)速度。底物濃度較小即ACE 抑制肽含量較少時(shí)，溶液濃度較低二者相互接觸更加容易，所以ACE 抑制率隨底物濃度的增加而增大。但底物濃度過高時(shí)ACE 抑制肽濃度也隨之增大，此時(shí)ACE 抑制肽之間可能會(huì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，減小了其與ACE 間可接觸作用的表面積。此時(shí)表現(xiàn)為ACE抑制率隨底物濃度增加而減小[22?23]。因此，選擇底物濃度為3%。

圖2 底物濃度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.2 超聲處理時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖3可知，隨超聲時(shí)間增長(zhǎng)，ACE 抑制率先增加后降低。超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，ACE 抑制率達(dá)到最大值74.03%。適當(dāng)時(shí)間的超聲處理可破壞細(xì)胞壁釋放胞內(nèi)物質(zhì)給蛋白酶提供更多的酶切位點(diǎn)，超聲時(shí)間過長(zhǎng)有可能將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，影響ACE 抑制肽的提取，降低其抑制率。因此，選擇超聲時(shí)間為20 min。

圖3 超聲處理時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.3 超聲功率對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖4可知，隨著超聲功率的增加，ACE 抑制率先增加后降低，超聲功率為180 W 時(shí)，ACE 抑制率達(dá)到最大值74.52%。適當(dāng)?shù)某暪β誓軌蚱茐募?xì)胞壁，為蛋白酶提供更多的酶切位點(diǎn)。因此，選擇超聲功率為180 W。

圖4 超聲功率對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.4 酶解溫度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，ACE 抑制率先增加后降低，酶解溫度為45 ℃時(shí)，ACE 抑制率達(dá)到最大值74.60%。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性蛋白酶失活，酶解度下降，ACE 抑制肽含量降低，ACE 抑制率減少[24]。因此，選擇酶解溫度為45 ℃。

圖5 酶解溫度對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖6可知，前3 h 隨酶解時(shí)間的增加，ACE 抑制率逐漸增加。3 h 后，ACE 抑制率趨于平緩，這可能是時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白酶活性降低或底物量不足導(dǎo)致反應(yīng)終止。酶解時(shí)間3 h 時(shí)，ACE 抑制率為最大值74.48%。因此，選擇酶解時(shí)間為3 h。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.6 加酶量對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖7可知，隨加酶量的增加，ACE 抑制率逐漸增加后平穩(wěn)，加酶量5000 U/g 時(shí)，ACE 抑制率達(dá)到最大值74.13%。因此ACE 抑制率并不會(huì)隨著加酶量增高而不斷變高，而是達(dá)到峰值后趨于穩(wěn)定。為了節(jié)約生產(chǎn)成本，選擇加酶量為5000 U/g。

圖7 加酶量對(duì)油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.7 Effect of enzyme addition on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響油莎豆ACE 抑制率最大的主要因素有：酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、超聲功率（C），利用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

2.4.1 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表4中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸程：Y=+74.29+0.41A?0.50B+0.049C?0.27AB+0.095AC?0.43BC?1.73A2?2.67B2?0.97C2。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

由表5可知，模型P<0.0001，模型的決定系數(shù)R2=0.9646，調(diào)整系數(shù)R2adj=0.9845，說明該模型的擬合度很好。三個(gè)因素的顯著性影響大小依次為：酶解溫度>酶解時(shí)間>超聲功率。

表5 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 5 Response surface analysis of variance results

2.4.2 雙因素的交互作用 等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示交互作用顯著。

如圖8所示，酶解時(shí)間與溫度的交互作用三維立體圖的等高線圖為圓形，所以酶解時(shí)間與溫度的交互作用不顯著。

圖8 酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用Fig.8 Interaction between enzymolysis time and enzymolysis temperature

如圖9所示，超聲功率與酶解時(shí)間的交互作用三維立體圖的等高線圖為圓形，所以超聲功率與酶解時(shí)間的交互作用不顯著。

圖9 超聲功率與酶解時(shí)間的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic power and enzymolysis time

如圖10所示，超聲功率與溫度的交互作用三維立體圖的等高線圖為橢圓，所以超聲功率與溫度的交互作用顯著。

圖10 超聲功率與酶解溫度的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and enzymolysis temperature

2.4.3 最佳制備參數(shù)的確認(rèn)及驗(yàn)證 通過Design Expert8.0.6 軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到堿性蛋白酶酶解油莎豆蛋白制備ACE 抑制肽的最佳工藝條件為：底物濃度3%、超聲功率180 W、超聲處理時(shí)間20 min、加酶量5000 U/g、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間3 h，預(yù)測(cè)此條件下ACE 抑制率為74.45%。按照上述最佳條件進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到ACE 抑制率的平均值為74.16%?；窘咏囼?yàn)所獲得的理論值，表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間有很好的擬合性，因此本研究中利用響應(yīng)面法獲得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面法優(yōu)化了油莎豆ACE 抑制肽的提取工藝，確定了超聲輔助堿性蛋白酶法提取ACE 抑制肽的最佳條件:超聲處理時(shí)間20 min、溫度45 ℃、超聲功率180 W、底物濃度3%、加酶量5000 U/g、酶解時(shí)間3 h，此條件下油莎豆ACE 抑制肽的抑制率為74.16%。其中對(duì)最終提取效果影響較大的因素是酶解時(shí)間、超聲功率、溫度，因此提取過程本質(zhì)上的影響因素可以歸結(jié)為酶活性的高低以及酶活性位點(diǎn)與蛋白結(jié)合的難易程度。本研究對(duì)酶法提取ACE 抑制肽工藝具有一定的參考價(jià)值，但是ACE 抑制實(shí)驗(yàn)中的抑制率還存在較大的上升空間仍需繼續(xù)探索。