秋水仙素誘變對油莎豆出苗率及品質(zhì)的影響

魏尊苗，劉佳遙，程 艷，王占海，許方達，陳 欣，牟忠生

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟植物研究所，吉林 長春 130033）

油莎豆是集油、糧、牧、飼于一體的新興經(jīng)濟作物，富含脂肪、淀粉、糖、維生素和礦物質(zhì)。其中，脂肪含量約為30%，非洲有些油莎豆品種脂肪含量在40%以上[1]。大力發(fā)展油莎豆產(chǎn)業(yè)，可增加油脂、淀粉和飼料供應(yīng)，緩解能源短缺，對保障我國食用植物油、糧食和動物蛋白質(zhì)供給安全等有重要的現(xiàn)實意義和戰(zhàn)略意義。油莎豆開花一般不結(jié)實[2]，即使結(jié)實成熟度也不好[3]，主要以塊莖繁殖。目前，油莎豆育種主要通過系選和誘變的方法，誘變育種可以提高突變頻率、創(chuàng)造新基因，縮短育種年限，被廣泛應(yīng)用。何嘉欣等[4]開展了EMS溶液對油莎豆塊莖萌發(fā)特性的影響研究，確定了油莎豆EMS 誘變的最適條件。秋水仙素是使用范圍廣且處理效果較好的誘變劑[5]，在大棗[6]、蘋果[7]、黃瓜[8]、西瓜[9]、萬壽菊[10]等作物上均有應(yīng)用，但在油莎豆塊莖上的報道很少。吳瓊[11]采用秋水仙素誘變油莎豆離體莖尖，獲得了染色體加倍的植株。李佳婷[12]用秋水仙素處理油莎豆無菌苗，獲得了四倍體油莎豆植株。但尚未見秋水仙素誘變油莎豆塊莖和誘變后塊莖品質(zhì)分析的報道。為此，利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液分別誘變萌發(fā)前和萌發(fā)后油莎豆塊莖，以期確定油莎豆塊莖秋水仙素誘變半致死劑量，并對誘變株塊莖的品質(zhì)進行檢測，分析秋水仙素誘變對油莎豆塊莖品質(zhì)的影響，從誘變材料中篩選出高品質(zhì)變異株，為油莎豆品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗于2021 年6—10 月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟植物研究所試驗地進行，土質(zhì)為砂壤土。

供試油莎豆為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟植物研究所油莎豆團隊自育品系SS4-3（長粒型），發(fā)芽率在95%以上。化學(xué)誘變劑為秋水仙素，購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 秋水仙素溶液的制備 采用8.5 g/L NaCl 溶液溶解秋水仙素，分別稱取秋水仙素粉末，配制質(zhì)量濃度為0（CK）、1、2、3、4 g/L的秋水仙素溶液。

1.2.2 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖 選擇飽滿無蟲眼油莎豆塊莖900 粒，用0.3%多菌靈浸泡15 min，然后于35 ℃恒溫箱中清水浸泡12 h，充分吸水后取出，用濾紙將其表面水分吸干，室溫下，分別用上述5 個不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液浸泡，設(shè)3 個誘變時間，分別為12、24、36 h，共15 個處理，每個處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)20 粒。浸泡處理結(jié)束，用流水沖洗5 遍，放置發(fā)芽盤中35 ℃催芽，統(tǒng)一進行播種，株距10 cm，行距65 cm，施用復(fù)合肥1 000 kg/hm2，進行常規(guī)田間管理。1 個月后統(tǒng)計出苗數(shù)，計算出苗率。

1.2.3 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖 選擇飽滿無蟲眼油莎豆塊莖1 000 粒，用0.3%多菌靈浸泡15 min，然后于35 ℃恒溫箱中清水浸泡12 h，充分吸水后取出，放到發(fā)芽盤中35 ℃催芽，每天清洗一遍，萌發(fā)后挑選發(fā)芽一致的900粒，用濾紙吸干表面水分后立即進行誘變處理，誘變劑質(zhì)量濃度、誘變時間及田間管理等均與1.2.2相同。

1.3 測定項目及方法

油莎豆塊莖成熟后人工單株收獲，清洗表面，自然晾曬，含水量降到約13%后采用近紅外谷物分析儀（波通7250A）對誘變塊莖進行品質(zhì)檢測，包括脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、總糖含量、淀粉含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22 軟件進行處理、統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖對出苗率的影響

使用秋水仙素對萌發(fā)前油莎豆塊莖進行誘變（表1），發(fā)現(xiàn)油莎豆出苗率總體上隨著秋水仙素質(zhì)量濃度和誘變時間的增加而逐漸降低。正常條件下，油莎豆出苗率最高可達到96.66%；在秋水仙素質(zhì)量濃度4 g/L、誘變時間36 h條件下，出苗率最低，為20.00%；在秋水仙素質(zhì)量濃度1 g/L、誘變時間24 h條件下，出苗率為51.67%，接近半致死劑量。

表1 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖對出苗率的影響Tab.1 Effect of colchicine mutagenesis before tuber germination on emergence rate of tigernut

方差分析結(jié)果（表2）顯示，使用秋水仙素對萌發(fā)前油莎豆塊莖進行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度對油莎豆出苗率的影響達到極顯著水平，誘變時間對出苗率的影響達到顯著水平。

表2 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖對出苗率影響的方差分析Tab.2 Variance analysis of effect of colchicine mutagenesis on emergence rate of tigernut before germination

2.2 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖對出苗率的影響

使用秋水仙素對萌發(fā)后油莎豆塊莖進行誘變（表3），發(fā)現(xiàn)油莎豆出苗率隨著秋水仙素質(zhì)量濃度和誘變時間的增加而逐漸降低。正常條件下，油莎豆出苗率最高可達到98.33%；在秋水仙素質(zhì)量濃度4 g/L、誘變時間36 h 條件下，出苗率最低，為36.67%；在秋水仙素質(zhì)量濃度3 g/L、誘變時間36 h條件下，出苗率為48.33%，接近半致死劑量。與萌發(fā)前油莎豆塊莖秋水仙素誘變處理相比，萌發(fā)后油莎豆塊莖秋水仙素誘變處理達到半致死劑量的秋水仙素質(zhì)量濃度更高、誘變時間更長，說明萌發(fā)后油莎豆塊莖比萌發(fā)前油莎豆塊莖抗誘變能力更強，對秋水仙素的敏感度更低。

表3 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖對出苗率的影響Tab.3 Effect of colchicine mutagenesis after tuber germination on emergence rate of tigernut

方差分析結(jié)果（表4）顯示，使用秋水仙素對萌發(fā)后油莎豆塊莖進行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度對油莎豆出苗率的影響達到極顯著水平，誘變時間對出苗率的影響達到顯著水平，與萌發(fā)前誘變結(jié)果一致。

表4 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖對出苗率影響的方差分析Tab.4 Variance analysis of effect of colchicine mutagenesis after tuber germination on emergence rate of tigernut

2.3 秋水仙素誘變對油莎豆塊莖芽形態(tài)的影響

萌發(fā)前油莎豆塊莖經(jīng)秋水仙素誘變處理后放置發(fā)芽盤中35 ℃催芽，3 d 后開始陸續(xù)發(fā)芽，經(jīng)觀察，部分芽存在明顯變異，共有3 種變異類型，分別為圓形、錐形、半圓半尖（圖1），萌發(fā)后油莎豆塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后芽無明顯變化。

圖1 萌發(fā)前油莎豆塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后芽形態(tài)的變化Fig.1 Changes in tigernut bud morphology caused by colchicine mutagenesis on tigernut tuber before germination

2.4 秋水仙素誘變油莎豆塊莖品質(zhì)分析

2.4.1 秋水仙素誘變油莎豆塊莖品質(zhì)變化 經(jīng)秋水仙素誘變的油莎豆塊莖成熟時，每個誘變處理選取3 個誘變株，收獲塊莖并曬干后，進行品質(zhì)檢測（表5）。由表5 可知，油莎豆塊莖萌發(fā)前誘變處理品質(zhì)指標的變異系數(shù)為13.97%～22.24%，平均正向變異率為59.72%；油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理品質(zhì)指標的變異系數(shù)為11.69%～18.78%，平均正向變異率為56.95%?？傮w上萌發(fā)前油莎豆塊莖秋水仙素誘變處理塊莖品質(zhì)指標的變異系數(shù)和正向變異率均略高于萌發(fā)后誘變處理。正向變異率最高的是油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理蛋白質(zhì)含量，為94.44%；正向變異率最低的是油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理總糖含量，為5.56%。對油莎豆塊莖萌發(fā)前和萌發(fā)后誘變處理的4個品質(zhì)指標正向變異率進行比較，發(fā)現(xiàn)油莎豆塊莖萌發(fā)前誘變處理和萌發(fā)后誘變處理的脂肪含量正向變異率相同，油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理蛋白質(zhì)含量和淀粉含量正向變異率高于萌發(fā)前誘變處理，萌發(fā)前誘變處理總糖含量正向變異率遠高于萌發(fā)后誘變處理。

表5 秋水仙素誘變油莎豆塊莖品質(zhì)變異分析Tab.5 Analysis of tigernut tuber quality mutation induced by colchicine

2.4.2 油莎豆高品質(zhì)變異材料的篩選 根據(jù)育種目標，在油莎豆誘變株中篩選出7 個高品質(zhì)變異材料（表6）。其中，5 個為油莎豆塊莖萌發(fā)前誘變獲得，2 個為油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變獲得。在高品質(zhì)變異材料中，淀粉含量大于32%的有1個，為油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變所得；總糖含量大于36%的有6個，其中，萌發(fā)前誘變獲得5 個，萌發(fā)后誘變獲得1 個。未獲得脂肪含量大于27%的誘變材料。

表6 7個油莎豆高品質(zhì)誘變材料近紅外品質(zhì)檢測Tab.6 Near infrared quality test data of 7 high-quality mutagenic materials

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，油莎豆出苗率隨秋水仙素質(zhì)量濃度和誘變時間的增加而降低，誘變時間對出苗率有顯著影響，秋水仙素質(zhì)量濃度對出苗率有極顯著影響，秋水仙素質(zhì)量濃度對出苗率的影響大于誘變時間，這與任雪羽[13]用秋水仙素誘變木槿種子，任威威[14]用秋水仙素誘變花生種子得出的結(jié)論相同。油莎豆塊莖萌發(fā)前進行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度1 g/L、誘變時間24 h 為其半致死誘變劑量；油莎豆塊莖萌發(fā)后進行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度3 g/L、誘變時間36 h 為其半致死誘變劑量，以誘變質(zhì)量濃度低且誘變時間短達到半致死劑量為原則，秋水仙素質(zhì)量濃度1 g/L、誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖24 h為其最適秋水仙素誘變半致死劑量，萌發(fā)前油莎豆塊莖對秋水仙素更敏感。祝朋芳等[15]采用秋水仙素誘變菊花干種子、萌動種子、雙子葉期植株，半致死劑量分別為2 g/L 處理1 d、2 g/L 處理0.5 d、20 g/L 處理6 d，同樣得出秋水仙素誘變萌動的種子比干種子和雙子葉期植株需要的質(zhì)量濃度低且時間短。植物誘變一般選擇種子、芽、莖尖、花粉、愈傷組織等生命力較強、分裂旺盛的部位或組織，油莎豆主要以塊莖繁殖，所以本研究以油莎豆塊莖作為誘變材料，分別選取了萌發(fā)前塊莖和萌發(fā)后塊莖進行誘變，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)前塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后部分芽表現(xiàn)出畸形，萌發(fā)后塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后芽無明顯變化，可見萌發(fā)前塊莖對誘變劑更敏感，萌發(fā)前塊莖秋水仙素誘變半致死劑量在相同時間下比萌發(fā)后誘變低，說明萌發(fā)前油莎豆塊莖是較合適的化學(xué)誘變材料。

品質(zhì)育種的目標是改良和提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)，秋水仙素誘導(dǎo)植物加倍可提高品質(zhì)。彭丹[16]采用秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體不結(jié)球白菜烤青和夏帝與二倍體相比，可溶性糖、維生素C含量和干質(zhì)量顯著提高。本研究雖未對誘變株做倍性鑒定，但是通過近紅外谷物分析儀對誘變株塊莖品質(zhì)進行檢測，獲得了6 個總糖含量增加的高糖變異株和1 個淀粉含量增加的高淀粉變異株，同樣證實了秋水仙素誘變可使油莎豆品質(zhì)提高，是油莎豆品質(zhì)育種的有效方法之一。本研究未篩選出高油變異材料，可能與所選基礎(chǔ)材料脂肪含量低有關(guān)，吉莎系SS4-3 脂肪含量較低，僅為14.26%，雖然變異空間較大，正向變異率也較高，達到66.67%，但是基數(shù)小，最后達到的峰值有限。所以若要獲得某個品質(zhì)指標高的誘變材料，首先應(yīng)選擇此品質(zhì)指標相對較高的基礎(chǔ)材料，此結(jié)論只是初步推斷，還需進一步驗證。

秋水仙素誘導(dǎo)多倍體鑒定的方法，主要有形態(tài)學(xué)觀測、染色體計數(shù)、氣孔觀測、流式細胞儀測定[13]、葉綠素含量測定[14]等，多種鑒定方法之間相互驗證，得出的結(jié)果更準確，也可以根據(jù)多倍體抗逆性強的特點[17]，嘗試采用脅迫法鑒定油莎豆誘變植株倍性。郭啟高等[18]通過低溫脅迫法（5 ℃5 h）和高溫脅迫法（50 ℃10 h）檢測出西瓜四倍體平均符合程度在80%以上，證實脅迫法可用。油莎豆屬新興植物，學(xué)者對其染色體研究較少，且油莎豆為無性繁殖，遺傳背景不詳，此前國外學(xué)者報道油莎豆染色體有18 條、108 條和208 條[19]。目前為止，油莎豆染色體數(shù)量及倍性還無定論，現(xiàn)階段對油莎豆誘變株進行染色體計數(shù)鑒定有一定難度，下一步將對秋水仙素誘變的油莎豆植株進行染色體倍性鑒定等深入研究。