檸檬烯抑菌機(jī)理及其在果蔬保鮮中應(yīng)用的研究進(jìn)展

王佳宇，胡文忠,*，管玉格，于皎雪，趙曼如

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024）

微生物是引起果蔬腐敗變質(zhì)的主要原因，而使用防腐劑可以有效抑制致腐微生物生長，減緩新鮮果蔬腐敗變質(zhì)，提高其感官品質(zhì)，延長貨架期[1?2]。但是由于目前化學(xué)防腐劑的安全殘留性問題已不能滿足消費(fèi)者對于食品安全的高要求，近年來經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效的天然生物防腐劑逐漸成為果蔬保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3?4]。

檸檬烯（Limonene）又名苧烯，是一種單環(huán)單萜烯，可主要從橘皮精油、柑桔油、白（青）檸檬油、甜橙油、佛手油、柚子油以及欖香樹脂等精油中提取[5?6]。檸檬烯具有良好的抑菌作用，可有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、黑曲霉菌以及魯氏酵母等生長，且其安全性較高，于20世紀(jì)90年代已被世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道為無致癌性、無遺傳毒性。美國食用香料與提取物制造商協(xié)會認(rèn)定其為一般公認(rèn)安全級（Generally Recognized as Safe，GRAS），國際日用香精香料協(xié)會（Internatioal Fragrance Association，IFRA）不限定檸檬烯的用量，并已經(jīng)過了美國食品藥品局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的批準(zhǔn)使用[7]。且有研究表明，檸檬烯被攝入機(jī)體后，大部分都可隨汗液、尿液等排出，不會在體內(nèi)積累對人體產(chǎn)生毒副作用，因此其近年來已被廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮領(lǐng)域[8]。本文主要是對檸檬烯的抑菌作用及其在果蔬保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，并討論了其在今后的發(fā)展方向，以期為檸檬烯在果蔬以及其他食品保鮮應(yīng)用中的進(jìn)一步研究提供參考。

1 檸檬烯的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及功效作用

1.1 結(jié)構(gòu)

檸檬烯化學(xué)名為1-甲基-4-異丙基環(huán)己烯，分子式為C10H16，分子量為163.24，主要以3 種構(gòu)型的異構(gòu)體形式存在，分別為L-檸檬烯、DL-檸檬烯和D-檸檬烯。在果蔬中檸檬烯主要以D-檸檬烯（即右旋檸檬烯）構(gòu)型的異構(gòu)體形式存在，其含量可占95%以上，而L-檸檬烯（左旋檸檬烯）和DL-檸檬烯（二聚異戊二烯）構(gòu)型的異構(gòu)體含量較低[9]。D-檸檬烯的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示[10]。

圖1 D-檸檬烯分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structural formula of D-limonene

1.2 理化性質(zhì)和功效作用

檸檬烯是一種具有類似于檸檬香氣，呈無色或者淡黃色的油狀液體，其不溶于水，易溶于乙酸乙酯、正己烷、乙醇以及丙酮等有機(jī)溶劑[11]。檸檬烯在光照、空氣與水分條件存在下極易氧化為檸檬烯過氧化物，而檸檬烯過氧化物不穩(wěn)定，會進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香芹酮、香芹醇等雜質(zhì)，因此提取檸檬烯的過程要極其小心。而目前提取檸檬烯的方法主要有蒸餾法（又分為水蒸氣蒸餾法、減壓蒸餾法和分子蒸餾法）、有機(jī)溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法以及超聲波輔助提取法等，其中，超臨界CO2萃取法是目前比較理想的檸檬烯提取方法，可使檸檬烯的萃取得率達(dá)80%以上[12?13]。檸檬烯具有良好的生理活性與功效作用，如抗腫瘤[14?22]、抗氧化[23?24]、降低肝臟損傷[25]、緩解失眠與焦慮[26]、祛痰平喘以及利膽溶石[27]等。

2 檸檬烯的抑菌作用及抑菌機(jī)理

2.1 抑菌作用

食品在加工和貯藏過程中極易受大腸桿菌（Escherichia coil）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）以及蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等細(xì)菌的污染，嚴(yán)重影響食品感官品質(zhì)以及增加潛在的安全性問題[28]。而近年來國內(nèi)外學(xué)者對于檸檬烯抗菌性的研究證明，檸檬烯可以有效地抑制細(xì)菌生長，如章斌等[29]為探討尤力克檸檬果皮精油中檸檬烯的抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以有效抑制大腸桿菌（Escherichia coil）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生長，抑菌圈直徑分別達(dá)（9.19±0.64）、（9.44±0.27）、（9.78±0.26）mm；馮堃等[30]使用牛津杯法同樣證明檸檬烯可有效抑制大腸桿菌（Escherichia coil）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）以及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生長和繁殖，這與章斌等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。除此之外，檸檬烯同樣還可對一些其他細(xì)菌起到抑制作用，詳見表1所示[28]。

表1 檸檬烯對細(xì)菌的抑制作用Table 1 Inhibit effect of limonene on bacteria

檸檬烯的廣譜抑菌性還體現(xiàn)在其對真菌也有一定的抑制作用，可有效抑制黑曲霉菌（Aspergillus niger）、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、魯氏酵母（Saccharomyces rouxiiBoutroux）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliformeSheld）以及啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等的生長，詳見表2所示[28]。

表2 檸檬烯對真菌的抑制作用Table 2 Inhibit effect of limonene on fungus

2.2 抑菌機(jī)理

精油以其廣譜的抑菌性、優(yōu)良的抑菌活性以及安全無毒的優(yōu)勢，近年來在抑菌方面得到了廣泛的關(guān)注，其中，普遍推測是由于微生物細(xì)胞膜與植物精油的疏水性成分相結(jié)合，從而導(dǎo)致微生物的結(jié)構(gòu)被破壞，甚至死亡。Burt[42]系統(tǒng)地論述了精油的抑菌機(jī)理，并且陳述了植物精油對微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的多個(gè)作用靶點(diǎn)，這些作用方式主要包括破壞細(xì)胞膜、降解細(xì)胞壁、破壞膜蛋白、凝結(jié)細(xì)胞質(zhì)、損耗質(zhì)子主動運(yùn)輸力以及使細(xì)胞內(nèi)溶物滲出等，如圖2所示[42?43]。

圖2 精油對菌體細(xì)胞抑制作用的靶點(diǎn)[38-39]Fig.2 Locations in the microbial cell thought to be sites of action foressential oil[38-39]

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對于檸檬烯的抑菌機(jī)理進(jìn)行了較長時(shí)間的深入研究，但同大部分的植物精油一樣，目前對其抑菌機(jī)理還未有明確的結(jié)論，許多學(xué)者也在進(jìn)一步探討之中。微生物細(xì)胞壁是維持其外形、協(xié)助細(xì)胞運(yùn)動、抑制滲透和機(jī)械損傷以及防止大分子入侵等生理功能的重要結(jié)構(gòu)[44?45]，有研究表明微生物細(xì)胞壁是檸檬烯作用的首要靶點(diǎn)，其可以通過調(diào)控果膠甲酯酶（PEP）和纖維素酶（CAS）的活性，破壞細(xì)胞壁使其死亡；也有些學(xué)者認(rèn)為檸檬烯可以通過干擾微生物菌體內(nèi)正常的能量代謝途徑，如破壞膜電位平衡、降低質(zhì)子動力以及使三磷酸腺苷（ATP）合成受阻等，從而打破微生物代謝平衡使其死亡，而且檸檬烯在濃度為5×10?3mol/L 時(shí)即可起到抑制作用[46]；也有研究表明檸檬烯可通過作用于微生物的細(xì)胞膜，破壞其完整性，使細(xì)胞出現(xiàn)破裂、孔洞以及塌陷等現(xiàn)象，引起細(xì)胞內(nèi)溶物外泄露出，從而導(dǎo)致細(xì)胞正常的生長繁殖受阻。此外研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，檸檬烯除了以滲透作用進(jìn)入細(xì)胞膜外，其還可以透過線粒體膜，從而使微生物菌體的細(xì)胞器和相同離子滲出過程中的滲透率增大[47]；除此之外，胡菲菲[48]探究釀酒酵母耐受D-檸檬烯脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)分析得出，D-檸檬烯可使釀酒酵母細(xì)胞中具有調(diào)控細(xì)胞增殖分裂功能的Cpr1p 和DNA 修復(fù)能力的Rpt4p 下調(diào)，從而抑制釀酒酵母細(xì)胞增殖，這也為檸檬烯的抑菌機(jī)制提供了重要線索。

而在目前的研究中，檸檬烯通過作用于微生物細(xì)胞膜從而達(dá)到抑制其生長繁殖目的的抑菌機(jī)理得到了普遍認(rèn)同。整個(gè)過程中，檸檬烯的疏水性可使其能夠擴(kuò)散通過磷脂雙層膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸比例變化，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被改變，最終使微生物死亡，該抑菌機(jī)理也得到了許多學(xué)者的驗(yàn)證。如Pasqua 等[49]使用掃描電鏡探究檸檬烯對金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌和嗜熱甲烷八聯(lián)球菌細(xì)胞膜的影響，研究發(fā)現(xiàn)，檸檬烯作用于受試菌后，能夠引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化，且細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量明顯減少；Pasqua 等[50]也提出大腸桿菌O157:H7、葡萄球菌經(jīng)檸檬烯作用后，經(jīng)掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)上述微生物的細(xì)胞膜發(fā)生了明顯的變化，且經(jīng)測定同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量明顯下降；這在探究檸檬烯處理大腸桿菌、熒光假單胞菌以及銅綠假單胞菌等抑菌機(jī)理時(shí)也得到了相似結(jié)果[36?37]。

3 檸檬烯在果蔬保鮮中的應(yīng)用

新鮮果蔬含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及多種人體必需的礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，且熱量低，因此廣受消費(fèi)者的青睞[51?52]。然而大多數(shù)新鮮果蔬由于在采摘、運(yùn)輸、貯藏以及銷售過程中受到的機(jī)械損傷，極易遭受微生物侵染，而微生物是導(dǎo)致果蔬發(fā)生腐敗變質(zhì)最主要因素之一。雖然果蔬內(nèi)含有次生代謝產(chǎn)物可暫時(shí)抵御微生物的生長，但微生物可通過產(chǎn)生毒性化合物或者以發(fā)酵的方式逐漸改變果蔬內(nèi)的環(huán)境以達(dá)到其生存的目的，從而造成果蔬營養(yǎng)成分流失、感官品質(zhì)下降，并引發(fā)一系列潛在的食品安全問題[53?54]。研究發(fā)現(xiàn)將檸檬烯單獨(dú)處理或與其他制劑復(fù)配處理新鮮果蔬后，均可有效達(dá)到抑制微生物生長、保留新鮮果蔬營養(yǎng)成分以及提高感官品質(zhì)的作用。

3.1 單獨(dú)檸檬烯處理

由于檸檬烯自身溶解度較低，因此在果蔬保鮮應(yīng)用中為提高檸檬烯溶解度需要提前將其乳化，而目前大多數(shù)研究的乳化方法為檸檬烯:蛋黃卵磷脂=25:2 混合處理。研究發(fā)現(xiàn)青椒經(jīng)檸檬烯乳化液處理后，對其腐爛有明顯的抑制作用，可將腐爛率降低30%，并且其也可以降低青椒相對電導(dǎo)率，減緩細(xì)胞膜透性，從而保護(hù)青椒細(xì)胞膜系統(tǒng)，將細(xì)胞膜損傷程度降低2.103 倍[55]；趙菊蓮等[56]同樣探究檸檬烯乳化液對杏果實(shí)的保鮮效果，研究發(fā)現(xiàn)該處理可使杏果實(shí)表面形成一層保護(hù)膜，延緩其在貯藏期間呼吸作用、能量代謝等生理活動，同時(shí)還可有效抑制致腐微生物入侵，降低杏果實(shí)腐敗變質(zhì)的發(fā)生；除此之外，學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)使用檸檬烯乳化液處理油桃[57]、草莓[58]和菠菜[59]后，其也可以有效減緩上述果蔬維生素C、可溶性固形物以及可滴定酸的分解與消耗，提高油桃、草莓和菠菜在貯藏期間的營養(yǎng)價(jià)值與商品價(jià)值，延長貨架期。

3.2 復(fù)合檸檬烯處理

近年來，一些學(xué)者還重點(diǎn)研究了檸檬烯與其它制劑聯(lián)合使用的果蔬保鮮技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)使用殼聚糖-檸檬烯涂膜與氣調(diào)貯藏（初始濃度：10% O2+CO2）相結(jié)合的方法對黃瓜進(jìn)行保鮮，可保持黃瓜在貯藏期間的失重率、硬度、pH、色澤、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等指標(biāo)，并且還可以通過抑制酵母菌和霉菌的生長繁殖來延緩黃瓜腐敗變質(zhì)的發(fā)生，延長其貨架期[60]；此外，學(xué)者們還研究發(fā)現(xiàn)用含有檸檬烯的可食性涂膜處理草莓同樣可以有效抑制酵母菌和霉菌的生長，并且還可以通過調(diào)控合成花青素途徑中的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，使草莓維持較高的花青素含量（43.849 mg/100 g），從而保持草莓鮮紅的色澤[61?62]；在芒果保鮮上，使用聚乙烯醇、殼聚糖和檸檬烯制成的包裝膜可有效抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長，使抑菌圈直徑分別為（6.61±0.04）和（6.88±0.02）mm，將芒果在貯藏期間的腐爛率降低至20%以下[63]，有效延緩了腐爛變質(zhì)的發(fā)生。

綜上，檸檬烯作為一種從橘皮精油中提取的天然、高效、安全的生物防腐劑已在一些果蔬保鮮應(yīng)用中取得了良好的效果，其在鮮切果蔬保鮮及其他食品保鮮行業(yè)也具有重要的應(yīng)用發(fā)展前景。

4 展望

檸檬烯作為一種優(yōu)良的天然植物精油，因具有廣譜的抑菌性，且安全性可靠已被廣泛應(yīng)用于食品保鮮、醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域，在市場上的應(yīng)用前景非常廣闊。但是目前國內(nèi)外對其抑菌機(jī)理的研究尚不明晰，對果蔬保鮮種類研究也較少，因此，今后可以著重探究檸檬烯的抑菌機(jī)理，以及增加檸檬烯對其他果蔬保鮮效果的研究，為其商業(yè)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。