響應(yīng)面優(yōu)化桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝

鄭升海，田樹(shù)林，王宇，樊蓉，龔大剛，杜鴻，曲都，徐升東，韓保林*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司，四川 南充 637000）

桑葚，又名桑果、桑葚子等。桑葚營(yíng)養(yǎng)豐富，富含黃酮類、萜類物質(zhì)、維生素、有機(jī)酸和微量元素等，為我國(guó)規(guī)定的藥食同源水果之一[1-2]，具有極高的保健價(jià)值和藥用價(jià)值，用于保護(hù)肝臟、腎臟，預(yù)防高血壓、糖尿病等，而且桑葚含有的糖類物質(zhì)可以作為免疫調(diào)節(jié)劑[3-5]。

桑葚季節(jié)性強(qiáng)，不易于保存，容易造成桑葚資源的大量浪費(fèi)。隨著食品科研的進(jìn)步和食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為了提高桑葚資源的利用率，減少資源浪費(fèi)，桑葚深加工產(chǎn)品也越來(lái)越多。目前，孫方丹[6]進(jìn)行了桑葚果醋的發(fā)酵工藝條件及生理活性研究，研制出具有獨(dú)特香氣的桑葚果醋；吳均等[7]進(jìn)行了響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化桑葚果酒發(fā)酵工藝及其品質(zhì)分析，釀造出了酒香馥郁的桑葚果酒；劉於[8]進(jìn)行了桑葚成分分析及低糖果醬的工藝參數(shù)優(yōu)化，研制出營(yíng)養(yǎng)豐富的低糖果醬。這些桑葚深加工食品得到了廣大群眾的喜愛(ài)和認(rèn)可[9]。

桑葚果酒作為桑葚主要深加工產(chǎn)品之一，具有獨(dú)特的風(fēng)味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，為果酒中的佳品[10]。Tao等[11]研究了不同釀酒酵母菌株發(fā)酵桑葚酒的化學(xué)成分和感官特征；胡永正[12]進(jìn)行了桑葚酒發(fā)酵工藝動(dòng)力學(xué)研究。關(guān)于桑葚果酒的研究多集中在桑葚果酒的發(fā)酵工藝優(yōu)化、風(fēng)味物質(zhì)分析、混合發(fā)酵應(yīng)用等，對(duì)于桑葚白蘭地的研究鮮有報(bào)道。為了提高桑葚的利用率，本試驗(yàn)采用干桑葚作為發(fā)酵原材料進(jìn)行果酒發(fā)酵，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，以期釀造出優(yōu)質(zhì)的桑葚白蘭地原料酒，提升與拓展桑葚食品產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)發(fā)展空間和潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干桑葚：采于四川閬中桑蠶基地；果酒專用酵母RW：安琪酵母有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：滇鵬糖業(yè)有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸（食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級(jí)）：煙臺(tái)帝伯仕酵母有限公司；對(duì)二氨基苯甲醛（分析純）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；鹽酸間苯二胺（分析純）：上海阿拉丁生化股份有限公司；甲醇、異戊醇、異丁醇（色譜純）：上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

BJ-800A粉碎機(jī)：德清拜杰電器有限公司；DZKW-4水浴鍋：北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；OHAUS-ST2C pH計(jì)：奧豪斯儀器有限公司；ZWYRD2403恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；T6分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LB50T ATC糖度折光儀：廣州市銘睿電子科技有限公司；三支組酒精計(jì)（0%vol～100%vol）：四川省申聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)及檢測(cè)方法

1.3.1 桑葚白蘭地原料酒工藝流程

干桑葚篩選→破碎→復(fù)水→滅菌→酶解→調(diào)節(jié)初始糖度→酵母活化接菌→控溫發(fā)酵→過(guò)濾→桑葚白蘭地原料酒。

工藝要點(diǎn)如下。

篩選、破碎：選取優(yōu)質(zhì)的干桑葚，通過(guò)粉碎機(jī)破碎成粉粒狀。

復(fù)水：稱取80 g干桑葚果粉粒加入發(fā)酵瓶，按料水比1∶4（g/mL）加水，制備成干桑葚果漿。

酸度調(diào)節(jié)：使用檸檬酸調(diào)節(jié)干桑葚果漿的pH值為3.5。

酶解：加入0.1%的果膠酶，并在50℃條件下酶解2h。

糖度調(diào)節(jié)：將干桑葚果漿使用白砂糖調(diào)節(jié)為不同的初始糖度（16、20、24、28、32、36 °Bé）。

滅菌：向干桑葚果漿中加入0.1%焦亞硫酸鉀，滅菌2 h～8 h。

酵母菌活化：將酵母菌加入糖度為2°Bé的無(wú)菌水中，于35℃下活化15 min～30 min。

發(fā)酵：向干桑葚果漿中添加適量的活化酵母菌進(jìn)行恒溫發(fā)酵。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

發(fā)酵溫度：固定酵母添加量為0.1%、初始糖度為28 °Bé、發(fā)酵時(shí)間為 15 d，測(cè)定不同發(fā)酵溫度（18、21、24、27、30、33℃）對(duì)桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝的影響。

初始糖度：固定酵母添加量為0.1%、發(fā)酵溫度為21℃、發(fā)酵時(shí)間為 15 d，測(cè)定不同初始糖度（16、20、24、28、32、36°Bé）對(duì)桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝的影響。

酵母接種量：固定初始糖度為28°Bé、發(fā)酵溫度為21℃、發(fā)酵時(shí)間為15 d，測(cè)定不同酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對(duì)桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）為考察因素，利用 Design-Expert8.06軟件以酒精度、甲醇含量為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行分析，獲得最優(yōu)預(yù)測(cè)發(fā)酵條件參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.3.4 測(cè)定方法

總酸含量、總酯含量、總糖含量、酒精度均采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定[13]；pH值測(cè)定采用酸度計(jì)法；糖度測(cè)定采用折光計(jì)檢測(cè)法；甲醇含量測(cè)定采用品紅亞硫酸比色法[14]。甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.735x-0.015 7，R2=0.997 9；高級(jí)醇含量測(cè)定采用對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法[14]，高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=174.65x+0.084 2，R2=0.998 9。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)[12]。

樣品萃取：取5 mL樣品加入15 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，40℃條件平衡30 min，將以活化好的萃取針插入頂空瓶，在距離液面1 cm處吸附30 min，取出萃取針迅速插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸附5 min。

色譜條件：高純氦氣（載氣），6 mL/min（吹掃流速），升溫條件：42℃（初始柱溫、恒溫8 min），升溫至130℃（速度5℃/min），再升至 220℃（速度10℃/min，恒溫10 min），最后升至230℃（速度10℃/min，恒溫 5 min）。

質(zhì)譜條件：電子離子源；電子能量：70 eV；采集模式：全掃描，質(zhì)量掃描范圍20 amu～550 amu，溶劑延遲2.5 min；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃，接口溫度：230℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝的影響

發(fā)酵溫度對(duì)桑葚白蘭地原料酒總酸、總酯、總糖、甲醇、高級(jí)醇、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量及酒精度的影響見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵溫度對(duì)總酸、總酯、總糖、甲醇、高級(jí)醇、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量及酒精度的影響Table 2 Effects of fermentation temperature on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances

由表2可知，隨著發(fā)酵溫度升高，總酸含量整體呈先升高后下降再升高趨勢(shì)；總酯含量整體呈波動(dòng)升高趨勢(shì)；總糖含量整體呈先下降后升高趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為21℃時(shí)，其總糖含量達(dá)到最低，為（4.23±0.24）g/L，原因是溫度升高會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致糖代謝減少，從而影響酒體品質(zhì)[15]；酒精度整體呈先升高后下降趨勢(shì)，21℃時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為（13.8±0.4）%vol；甲醇含量整體呈先下降后升高趨勢(shì)，在21℃時(shí)達(dá)到最小值，為（120.5±3.5）mg/L；高級(jí)醇含量隨溫度升高呈上升趨勢(shì)，溫度升高使酵母菌由生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期過(guò)早進(jìn)入穩(wěn)定期，從而發(fā)酵速度變快，發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間早，導(dǎo)致酒精濃度下降，高級(jí)醇含量反而增加；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量呈先升高后下降趨勢(shì)，21℃時(shí)達(dá)到最大值，為（1.44±0.04）g/L，低溫發(fā)酵有利于形成更好的果酒品質(zhì)，這與Tian等[16]研究的結(jié)果相一致。綜上，選取18、21、24℃的發(fā)酵溫度作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.2 初始糖度對(duì)桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝的影響

初始糖度對(duì)桑葚白蘭地原料酒總酸、總酯、總糖、甲醇、高級(jí)醇、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量及酒精度的影響見(jiàn)表3。

表3 初始糖度對(duì)總酸、總酯、總糖、甲醇、高級(jí)醇、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量及酒精度的影響Table 3 Effects of initial sugar content on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol content，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances

由表3可知，隨著初始糖度的升高，總酸含量整體呈下降趨勢(shì)；總酯含量呈先下降后升高趨勢(shì)；總糖含量呈升高趨勢(shì)，當(dāng)初始糖度為36°Bé時(shí)，其總糖含量達(dá)到最高，為（56.19±0.33）g/L，由于初始糖度的升高，導(dǎo)致發(fā)酵液的滲透壓升高，抑制酵母菌代謝生長(zhǎng)，使糖分利用不充分，導(dǎo)致總糖含量升高[17]；酒精度呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)初始糖度為28°Bé時(shí)，其酒精度達(dá)到最高，為（13.6±0.6）%vol；甲醇含量呈先下降后升高再下降趨勢(shì)，當(dāng)初始糖度為28°Bé時(shí)，其甲醇含量達(dá)到最低，為（121.4±6.1）mg/L，當(dāng)發(fā)酵初始糖度低于 28 °Bé時(shí)，由于糖分含量不足，酵母菌代謝途徑為糖類物質(zhì)代謝和其他物質(zhì)代謝，其他類物質(zhì)代謝產(chǎn)生甲醇，從而導(dǎo)致甲醇含量相對(duì)較高[18]；高級(jí)醇含量呈先下降后升高再下降趨勢(shì)；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量整體呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)初始糖度為28°Bé時(shí)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量達(dá)到最高，為（1.44±0.03）g/L，由于低初始糖度的糖含量不足與高初始糖度的糖含量過(guò)高對(duì)酵母菌代謝生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在低初始糖度與高初始糖度時(shí)的含量減少。綜上，選取24、28、32°Bé的初始糖度作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.3 酵母接種量對(duì)桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝的影響

酵母接種量對(duì)桑葚白蘭地原料酒總酸、總酯、總糖、甲醇、高級(jí)醇、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及酒精度的影響見(jiàn)表4。

表4 酵母接種量對(duì)總酸、總酯、總糖、甲醇、高級(jí)醇、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及酒精度的影響Table 4 Effects of yeast inoculation amount on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances

由表4可知，隨著酵母接種量的增加，總酸含量呈上升趨勢(shì)；總酯含量變化不顯著（P＞0.05）；總糖含量呈下降趨勢(shì)，由于酵母接種量增加，糖分消耗也隨之增加，導(dǎo)致總糖含量下降；酵母接種量由0.1%增加至0.2%時(shí)，酒精度升高，當(dāng)酵母接種量為0.2%～0.5%時(shí)，酒精度變化不顯著（P＞0.05），當(dāng)酵母接種量過(guò)高，酵母菌利用糖類物質(zhì)和其它養(yǎng)分，主要產(chǎn)生呼吸作用，產(chǎn)酒底物減少，導(dǎo)致產(chǎn)酒量少[19-20]；甲醇含量呈先下降后升高趨勢(shì)，當(dāng)酵母接種量為0.2%時(shí)，其甲醇含量達(dá)到最低，為（104.5±5.9）mg/L；高級(jí)醇含量整體呈先下降后升高趨勢(shì)，當(dāng)酵母接種量為0.2%時(shí)，其高級(jí)醇含量達(dá)到最低，為（193.5±3.6）mg/L；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)酵母接種量為0.2%時(shí)，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量達(dá)到最高，為（1.64±0.05）g/L；酵母接種量過(guò)少易使發(fā)酵不充分，酵母接種量過(guò)多易使發(fā)酵過(guò)快，從而導(dǎo)致酒精度、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量下降，甲醇、高級(jí)醇含量升高，直接影響果酒品質(zhì)的好壞[21-22]，綜上，選取0.1%、0.2%、0.3%的酵母接種量作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2 桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)，建立17組桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Design scheme and results of Box-Behnken test

2.2.2 以酒精度為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

以酒精度為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 以酒精度為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test with alcohol content as the indicator

二次多項(xiàng)回歸方程：Y=14.36＋0.68×A＋0.86×B＋0.11×C＋0.9×AB＋0.5×AC＋0.38×BC－0.79×A2－2.37×B2－0.72×C2。

由表6可知，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.973 8、R2adj=0.940 2，且模型P值小于0.01（表明模型極顯著），失擬項(xiàng)P值為0.075 5＞0.05（失擬項(xiàng)不顯著），證明該回歸模型方程擬合度較好，誤差小?？梢?jiàn)該模型準(zhǔn)確，可行性高，能用于本試驗(yàn)的預(yù)測(cè)分析[23]。一次項(xiàng)A、B極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng) AB 極顯著（P＜0.01），AC 顯著（P＜0.05），二次項(xiàng) A2、B2、C2極顯著（P＜0.01），C、BC 均不顯著（P＞0.05），由F值可知，3個(gè)因素對(duì)酒精度影響的大小順序?yàn)锽>A>C。

A、B、C兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖1。

圖1 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖（酒精度）Fig.1 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors（alcohol content）

由圖1可知，發(fā)酵溫度和初始糖度（AB）、發(fā)酵溫度和酵母接種量（AC）的響應(yīng)面圖坡度趨勢(shì)陡峭，AB、AC等高線趨于橢圓形，表明這兩組交互作用對(duì)酒精度影響較大，AB、AC交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 以甲醇含量為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

以甲醇含量為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 以甲醇含量為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 7 Variance analysis of response surface test with methanol content as the indicator

二次多項(xiàng)回歸方程：Y=115.14－2.85×A－3.26×B+0.25×C－3.21×AB－1.48×AC－2.11×BC＋5.54×A2＋12.37×B2＋6.5×C2。

由表7可知，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.972 8、R2adj=0.937 7，且試驗(yàn)結(jié)果中P值小于0.01（模型極顯著），失擬項(xiàng)P值為0.067 9＞0.05（失擬項(xiàng)不顯著），證明該回歸模型方程擬合度較好，誤差小，該模型準(zhǔn)確，可行性高，能用于本試驗(yàn)預(yù)測(cè)分析。A、B項(xiàng)影響極顯著（P＜0.01），AB 項(xiàng)影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），C、AC、BC 影響均不顯著（P＞0.05），由 F 值可知，3個(gè)因素對(duì)甲醇含量影響的大小順序?yàn)锽>A>C。

A、B、C兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖2。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖（甲醇含量）Fig.2 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors（methanol content）

由圖2可知，AB交互作用的響應(yīng)面坡度趨勢(shì)陡峭、等高線趨于橢圓形，表明AB交互作用對(duì)甲醇含量影響較大，AB交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.3 桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度21.9℃，初始糖度28.7°Bé，酵母接種量0.2%，此時(shí)，酒精度為14.6%vol，甲醇含量為114.4 mg/L。根據(jù)最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得酒精度為14.56%vol，甲醇含量為112.7 mg/L，與預(yù)測(cè)值接近，該參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)是以干桑葚為原料，在桑葚白蘭地原料酒發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，得到最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度21.9℃，初始糖度28.7°Bé，酵母接種量0.2%，理論預(yù)測(cè)值為酒精度14.6%vol，甲醇含量114.4 mg/L。根據(jù)此發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得酒精度為14.56%vol，甲醇含量為112.7 mg/L，與預(yù)測(cè)值接近。