歐前胡素對阿爾茨海默病模型小鼠SIRT1和磷酸化PERK/eIF2α及CHOP蛋白表達的影響

萬航娟，羅 麗，何 蔚

（1.贛南醫(yī)學院2019級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學院藥理學教研室；3.江西省腦血管藥理重點實驗室；4.心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制復雜。研究發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）在腦組織聚集形成淀粉樣斑塊及Aβ誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）持久應激反應導致神經(jīng)損傷可能是AD的重要發(fā)病機制之一。ER應激相關分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulated protein 78，GRP78），也稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP）或 HSPA5，是熱休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70）家族的成員，存在于所有真核生物的ER膜上，是ER的分子伴侶。GRP78具有防止錯誤折疊的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基轉(zhuǎn)運的作用。當?shù)鞍渍郫B錯誤時，機體發(fā)生未折疊蛋白反應（The unfolded protein response，UPR），UPR是ER應激觸發(fā)的一種機體適應性保護機制，旨在修復正常的ER功能。但是，持久或過度的ER應激可使UPR過度激活，UPR成為不良適應并可能促進細胞凋亡。蛋白激酶RNA樣ER激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum ki‐nase，PERK）是UPR反應的效應蛋白，當機體觸發(fā)UPR，GRP78從PERK解離，PERK自身二聚化和C端Thr980位點自我磷酸化，激活的PERK可增強真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor-2α，eIF2α）蛋白Ser51位點磷酸化激活，磷酸化的eIF2α增加ATF4的翻譯并誘導C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表達，CHOP在細胞的氧化應激反應中起重要作用，主要有抑制細胞生長、促進DNA損傷等作用。Aβ大量聚集可導致ER持久應激反應，進而促使PERK和eIF2α磷酸化激活，引起CHOP表達上調(diào)，誘發(fā)神經(jīng)損傷，導致AD發(fā)生和發(fā)展[1-2]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent information regula‐tor 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性組蛋白去乙?；福趹し磻图毎婊畹壬飳W過程中起著重要作用。近期研究證實，SIRT1可通過抑制細胞凋亡和自噬等多種機制防止ER應激誘導的細胞損傷[3]。SIRT1激活對包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)損傷具有保護作用，SIRT1可作為治療AD的潛在藥物靶點[4]。

歐前胡素（Imperatorin，IMP）是傘形科植物蛇床子、白芷、羌活等的有效成分之一，是一種呋喃香豆素。研究顯示，歐前胡素具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護等作用[5-8]，但其藥理作用及作用機制尚未完全闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素在跳臺實驗和八臂迷宮行為學實驗中對AD模型小鼠的學習記憶障礙具有明顯的改善作用，另外，歐前胡素可減輕Aβ1-42致AD模型小鼠的神經(jīng)性炎癥和氧化應激損傷[9-11]。但是，歐前胡素防治AD的作用機制還未完全闡明。本研究將觀察歐前胡素對SIRT1表達及對磷酸化PERK/eIF2α蛋白表達的影響，進一步探討歐前胡素防治AD的作用機制，為歐前胡素臨床上用于防治AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級BABL/c小鼠，雄性，體重20～25 g，湖南斯萊克景達有限公司提供，生產(chǎn)許可證SCXK（湘）2019-0004。實驗過程嚴格遵守實驗動物使用相關倫理規(guī)定。

1.2 藥品與試劑歐前胡素購自中國食品檢定研究所（批號110826-201918，純度99.5%），Aβ1-42購自sigma公司（貨號 A9810-0.1MG），pierceTMBCA Protein Assay Kit購自Thermo公司（貨號23227），LDH和MTT試劑盒購自南京建成有限公司，GRP78 ELISA檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，SIRT1 ELISA檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，β-actin（貨號 4979）、eIF2α（貨號9722）、p-eIF2α（貨號 9721）、GRP78（貨號 3177）、p-PERK（貨號3179）、SIRT1（貨號2493）、山羊抗兔IgG（貨號7074）均購自Cell Signaling Technology公司，CHOP購自博士德生物工程有限公司，SuperSignalTMWest Pico Plus Luminol/Enhancer購自美國Thermo公司，二甲亞砜購自美國sigma公司（貨號D2650）。

1.3 實驗儀器Bio-Rad電泳系統(tǒng)（Bio-rad公司），Thermo Variokan Flash全波長讀數(shù)儀（Thermo Fisher公司），TS-1000型脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），多用途旋轉(zhuǎn)搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），隔水式電熱恒溫培育箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），高速冷凍離心機（Thermo Fisher有限公司），恒溫浴槽HSS-1B（成都儀器廠），G box化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Syngene公司），振動切片機（英國Campden Instruments公司），分析天平（瑞士Mettler toledo公司）。

1.4 離體腦片損傷模型制備與分組SPF級BABL/c雄性小鼠，體重20～23 g，8周齡，購自湖南斯萊克景達實驗有限公司，自由飲食和自然條件下飼養(yǎng)1周，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg·kg-1），小鼠麻醉后快速斷頭取腦，置于預冷的氧飽和人工腦脊液中冷卻3 min后取出，使用振動切片機進行冠狀切片制備離體腦片，切片厚度為400 μm。提前在24孔板中加入適量人工腦脊液，切好的腦片迅速轉(zhuǎn)移到24孔板中，將24孔板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中（37 ℃、95% O2和5% O2）復蘇30 min，進行離體腦片實驗。腦片隨機分為五組，分別為正常對照組（control）、溶媒對照組（vehicle）、Aβ1-42組（Aβ1-42）、Aβ1-42+歐前胡素低劑量組（IMP-L）、Aβ1-42+歐前胡素高劑量組（IMP-H）。在腦片復蘇后，分別在溶媒對照組、歐前胡素低劑量組和歐前胡素高劑量組加入1%DMSO、10 μM和30 μM歐前胡素，孵育15 min后，分別在Aβ1-42組、歐前胡素低劑量組和歐前胡素高劑量組中加入10 μM Aβ1-42孵育12 h。

1.5 LDH活性檢測和MTT實驗腦片孵育結(jié)束后收集腦片，按照試劑盒說明書操作，用LDH活性檢測腦片損傷和MTT法檢測腦片活力。

1.6 ELISA檢測腦片組織中SIRT1和GRP78的含量按照試劑盒說明書處理腦片組織樣本，制備樣品，按照說明書的步驟嚴格操作，蛋白定量使用BCA蛋白定量法檢測。

1.7 小鼠AD模型的建立將滅菌用水加入Aβ1-42試劑瓶中，于37℃溫育箱孵育4 d。用10%水合氯醛（350 mg·kg-1）給小鼠腹腔注射，小鼠麻醉后進行側(cè)腦室內(nèi)注射，根據(jù)側(cè)腦室注射位點立體定位（AP：?0.5 mm，ML：±1.0 mm，DV：?2.5 mm），用10 μL微量注射器緩慢注射410 pmol（3 μL）Aβ1-42，注射結(jié)束后停針3 min再拔針。對照組小鼠注射相同體積的滅菌注射用水。

1.8 實驗動物分組與給藥雄性小鼠隨機分成正常對照組、AD模型組、AD模型+歐前胡素2.5 mg·kg-1組（IMP-L）、AD模型+歐前胡素5.0 mg·kg-1組（IMP-H）。歐前胡素給藥組自造模當天開始腹腔注射給藥，給藥體積為10 mL·kg-1，1次·d-1，連續(xù)13 d，正常對照組和AD模型組小鼠在相同時間腹腔注射等量溶媒進行對照。

1.9 小鼠海馬組織中蛋白的測定小鼠腹腔注射給藥連續(xù)13 d后，將動物麻醉斷頭取腦，分離出海馬組織并分裝于冷凍管中，液氮中保存，用于各觀察指標測定。按照試劑盒說明書處理海馬組織樣本，制備樣品，按照說明書的步驟嚴格操作，蛋白定量使用BCA蛋白定量法檢測。

1.10 Western Blot檢測蛋白的表達給藥13 d取小鼠的海馬組織，提取細胞總蛋白后，用BCA定量法將蛋白定量至100 μg，制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣20 μL，經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒壓轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，封閉后加一抗 SIRT1（1∶1 000），PERK（1∶1 000）、p-PERK（1∶500）、eIF2α（1∶1 000）、p-eIF2α（1∶500）、GRP78（1∶500）和 CHOP（1∶500）4℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜后，PVDF膜中加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。膜經(jīng)過TBST洗滌后，在暗室中加入顯影液，化學發(fā)光法檢測，掃描灰度值用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.11 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行分析，用GraphPad Prism軟件繪圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后LDH活性的影響與溶媒對照組相比，Aβ1-42損傷組小鼠腦片組織中LDH的活性明顯升高（P＜0.01）；與Aβ1-42損傷組比較，用10 μM和30 μM歐前胡素預處理后腦片組織中LDH活性明顯降低（10 μM組：P＜0.05，30 μM組：P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義（圖1）。

圖1 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后LDH活性的影響（n=6，±s）

2.2 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后腦片活力的影響與溶媒對照組相比，Aβ1-42損傷組小鼠腦片損傷后腦片活力降低（P＜0.05），與Aβ1-42損傷組比較，10 μM歐前胡素預處理組腦片活力有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學意義，30 μM歐前胡素預處理組腦片活力升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義（圖2）。

圖2 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后腦片活性的影響（n=4，±s）

2.3 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后SIRT1和GRP78含量的影響ELISA結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，Aβ1-42損傷組小鼠腦片SIRT1水平降低（P＜0.01）（圖3），GRP78水平升高（P＜0.05）（圖4）；與Aβ1-42損傷組比較，10 μM歐前胡素預處理組腦片組織中SIRT1水平有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學意義，30 μM歐前胡素預處理組腦片組織中SIRT1水平升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（圖3），10 μM和30 μM歐前胡素預處理組腦片組織中GRP78水平降低（10 μM組P＜0.05，10 μM組P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義（圖4）。

圖3 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后SIRT1含量的影響（n=6，±s）

圖4 歐前胡素對Aβ1-42致小鼠離體腦片損傷后GRP78含量的影響（n=6，±s）

2.4 歐前胡素對小鼠海馬組織中SIRT1蛋白表達的影響與假手術(shù)組比較，AD模型組小鼠的海馬組織中SIRT1的蛋白表達比假手術(shù)組低（P＜0.05）；與AD模型組比較，歐前胡素低劑量給藥組中SIRT1的蛋白表達有上升的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，歐前胡素高劑量給藥組中SIRT1的蛋白表達水平比AD模型組高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（圖5）。

圖5 歐前胡素對AD小鼠海馬組織中SIRT1蛋白表達的影響（n=4，±s）

2.5 歐前胡素對小鼠海馬組織中GRP78蛋白表達的影響與假手術(shù)組比較，AD模型組小鼠的海馬組織中GRP78的蛋白表達比假手術(shù)組高（P＜0.05）；與AD模型組比較，歐前胡素用藥組中GRP78的蛋白表達比AD模型組低（2.5 mg·kg-1組：P＜0.05，5.0 mg·kg-1組：P＜0.01）（圖6），提示歐前胡素可抑制GRP78的蛋白表達，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應有一定的抑制作用。

圖6 歐前胡素對AD小鼠海馬組織中GRP78蛋白表達的影響（n=4，±s）

2.6 歐前胡素對PERK、p-PERK、eIF2α和p-eIF2α蛋白表達的影響與假手術(shù)組相比，AD模型組小鼠的海馬組織中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均比假手術(shù)組高（對于p-PERK/PERK，P＜0.05；對于p-eIF2α/eIF2α，P＜0.01）。與AD模型組比較，2.5 mg·kg-1歐前胡素用藥組中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值變化均不明顯，差異均無統(tǒng)計學意義；5.0 mg·kg-1歐前胡素用藥組中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均比AD模型組低（P均＜0.01）（圖7，圖8）。提示歐前胡素可抑制AD小鼠的海馬組織中PERK和eIF2α的磷酸化激活。

圖7 歐前胡素對AD小鼠海馬組織中p-PERK/PERK的影響（n=4，±s）

圖8 歐前胡素對AD小鼠海馬組織中p-eIF2α/eIF2α的影響（n=4，±s）

2.7 歐前胡素對CHOP蛋白表達的影響與假手術(shù)組比較，AD模型組小鼠的海馬組織中CHOP的蛋白表達比假手術(shù)組高（P＜0.01）；與AD模型組比較，2.5 mg·kg-1歐前胡素給藥組CHOP的蛋白表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義，5.0 mg·kg-1歐前胡素給藥組CHOP的蛋白表達水平比AD模型組低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義（圖9）。

圖9 歐前胡素對AD小鼠海馬組織中CHOP的影響（n=4，-x±s）

3 討論

側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ1-42誘導AD模型是一種常用的“Aβ級聯(lián)反應假說”相關AD動物模型，被國內(nèi)外學者用于研究AD的發(fā)病機制以及用于篩選和評價藥物的抗AD作用。我們前期采用跳臺法觀察到歐前胡素能改善Aβ1-42致小鼠AD后學習記憶障礙，用八臂迷宮實驗觀察了歐前胡素對AD模型小鼠的空間學習記憶障礙的影響，提示歐前胡素對AD的學習記憶障礙具有保護作用。同時，本課題組還證實歐前胡素可減輕AD模型小鼠氧化應激反應和神經(jīng)性炎癥反應[9-11]。本實驗我們參照本課題組前期實驗，選用2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1腹腔注射給藥，連續(xù)給藥 13 d[9-11]，進一步觀察了歐前胡素對 Aβ1-42致AD模型小鼠ER應激反應及相關蛋白的影響。

ER應激反應是一種適應性保護機制，可防止應激后ER穩(wěn)態(tài)的破壞。研究證實，ER應激與AD的病理機制密切相關，輕微ER應激反應在AD發(fā)病中具有保護作用，過強的ER應激反應可導致細胞死亡，從而促進AD的發(fā)生發(fā)展[12-13]。GRP78是一種重要的ER分子伴侶，參與調(diào)控ER應激反應，GRP78是ER應激的重要標志蛋白。Aβ聚集可誘導ER應激反應及上調(diào)GRP78的表達[14]。本研究顯示，歐前胡素可抑制Aβ1-42致離體腦片損傷，減少LDH釋放，增加腦片活力，減少GRP78的產(chǎn)生。另外，給小鼠腦室內(nèi)注射Aβ1-42后海馬組織中GRP78的蛋白水平上調(diào)，歐前胡素用藥組小鼠海馬組織中GRP78蛋白水平較低，提示歐前胡素可抑制Aβ1-42誘導AD模型小鼠GRP78水平的上調(diào)，對Aβ1-42誘導小鼠海馬組織ER應激反應有一定程度的抑制作用。

研究顯示，在AD患者和AD實驗動物模型的大腦中PERK和eIF2α磷酸化激活水平均明顯上升，PERK和eIF2α信號通路激活是AD的重要發(fā)病機制之一[15]。PERK的基因缺失可抑制eIF2α Ser51位點的磷酸化激活，減輕神經(jīng)損傷，改善APP/PS1 AD小鼠的空間記憶障礙。研究還發(fā)現(xiàn)，另一種eIF2α激酶GCN2的缺失也可抑制eIF2α的磷酸化激活，抑制神經(jīng)損傷，從而改善APP/PS1小鼠空間記憶障礙[16]。本研究顯示，AD模型小鼠海馬組織中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均增加，歐前胡素用藥組海馬組織中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均比AD模型組低，提示歐前胡素可抑制PERK/eIF2α的磷酸化激活，緩解Aβ1-42誘導ER應激導致的神經(jīng)損傷，從而發(fā)揮對AD的神經(jīng)保護作用。

PERK/eIF2α磷酸化激活可增加ATF4的表達，進而誘導下游CHOP表達上調(diào)。CHOP具有抑制細胞生長和促進DNA損傷的作用。CHOP過表達可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，敲除CHOP基因或下調(diào)CHOP的表達可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應誘導的細胞凋亡[17]。本研究顯示，AD模型小鼠海馬組織中CHOP的蛋白表達明顯升高，歐前胡素可下調(diào)海馬組織中CHOP的蛋白表達，提示歐前胡素可能通過抑制CHOP的蛋白表達，緩解Aβ1-42誘導ER應激導致的神經(jīng)損傷。

SIRT1可通過增強細胞的抗應激能力促進細胞生存，對ER應激誘導的細胞損傷具有保護作用[18]。研究證實，SIRT1通過去乙?；饔迷谫嚢彼嵛稽c使eIF2α脫乙?；?，從而抑制PERK/eIF2α通路的過度活化[19]。ZHANG Y等[20]發(fā)現(xiàn)SIRT1通過降低Aβ的前體蛋白APP、提高BACE-1活性，對神經(jīng)細胞有保護作用。SIRT1天然激活劑可上調(diào)SIRT1的表達，減輕AD模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化和改善認知功能障礙。SIRT1的過表達可抑制Aβ1-42誘導的小膠質(zhì)細胞BV2細胞NF-κB途徑激活，并減輕Aβ對原代培養(yǎng)大腦皮層細胞的毒性[21]，促進SIRT1的表達，對AD模型實驗動物具有神經(jīng)保護作用[22]。本研究顯示，AD模型小鼠海馬組織中SIRT1的蛋白表達量明顯下降，歐前胡素可上調(diào)SIRT1的蛋白表達含量，提示歐前胡素可能通過上調(diào)SIRT1，減輕ER應激誘導的神經(jīng)損傷。

總之，歐前胡素可上調(diào)Aβ致AD模型小鼠海馬組織中SIRT1表達，抑制PERK/eIF2α的磷酸化激活，降低CHOP表達，減輕Aβ誘導ER應激反應所致的神經(jīng)損傷，這可能是歐前胡素防治AD的作用機制之一。本課題組將進一步研究歐前胡素抗AD的機制，為歐前胡素臨床用于治療AD提供理論依據(jù)。