不同時(shí)間點(diǎn)的氧糖剝奪對(duì)器官型海馬腦片的影響

楊　瀾，南麗紅，何一博，郭　斌，李　煌，黃　枚（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

不同時(shí)間點(diǎn)的氧糖剝奪對(duì)器官型海馬腦片的影響

楊瀾，南麗紅，何一博，郭斌，李煌，黃枚
（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

目的觀察不同時(shí)長(zhǎng)的氧糖剝奪對(duì)SD乳鼠器官型海馬腦片的影響，探討制備氧糖剝奪（OGD）模型的最佳時(shí)長(zhǎng)。方法對(duì)海馬腦片進(jìn)行碘化丙啶染色，用微量酶標(biāo)法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中LDH的釋放量。結(jié)果培養(yǎng)13 d后的腦片逐漸變薄，海馬結(jié)構(gòu)逐漸清晰，生長(zhǎng)情況逐漸穩(wěn)定，無(wú)特異性熒光信號(hào)，LDH釋放各組無(wú)明顯差異性；與造模前24 h相比，隨著缺氧缺糖時(shí)間的增加，海馬腦片碘化丙啶染色的熒光信號(hào)強(qiáng)度與LDH釋放量增加，以45、60 m in時(shí)長(zhǎng)最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），但氧糖剝奪60 m in腦片的損傷更為嚴(yán)重，表現(xiàn)出無(wú)法恢復(fù)的趨勢(shì)。結(jié)論制備SD乳鼠海馬腦片氧糖剝奪模型的最佳時(shí)長(zhǎng)為45min。

海馬腦片；氧糖剝奪；碘化丙啶；乳酸脫氫酶；OGD時(shí)間點(diǎn)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，因其發(fā)病突然、治療時(shí)間窗狹窄的特點(diǎn)，導(dǎo)致病后致殘率高［1］。器官型腦片培養(yǎng)是一種新興的腦組織體外培養(yǎng)技術(shù)，兼?zhèn)湓隗w實(shí)驗(yàn)的部分特點(diǎn)和離體實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，正成為腦卒中后康復(fù)研究的常用模型［2］。海馬對(duì)缺血缺氧較為敏感［3］，因此，器官型海馬腦片被廣泛應(yīng)用于缺血缺氧損傷相關(guān)機(jī)制的研究。我們擬在建立器官型海馬腦片制備和培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，探討不同時(shí)長(zhǎng)的氧糖剝奪（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）對(duì)器官型海馬腦片的影響，為進(jìn)一步研究藥物對(duì)腦卒中后的康復(fù)治療作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［4-6］。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物清潔級(jí)P7-9 SD乳鼠由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001。

1.2試劑MEM培養(yǎng)基 （美國(guó)Hyclone公司）；Hank's平衡鹽溶液（美國(guó)Hyclone公司）；細(xì)胞培養(yǎng)用青鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：J130071）；馬血清 （美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1296647）；D-（+）-Glucose（美國(guó) Sigma公司，批號(hào)：071M01452V）；Hepes（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBK4575V）；碘化丙啶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：MKBP1360V）；乳酸脫氫酶試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140929）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器Millicell-CM插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)Millipore公司）；5 000mz型振動(dòng)切片機(jī)（英國(guó)Campden Instruments公司）；Forma 371型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Galaxy CO170R型三氣培養(yǎng)箱 （美國(guó)NBS公司）；DM IL LED型倒置相差顯微鏡 （德國(guó)Leica公司）；EVOSFL型倒置熒光顯微鏡 （美國(guó)AMG公司）；SZ760型體視顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1腦片制備及培養(yǎng)制備方法參考Stoppini方法［7］加以改進(jìn)。P7-9乳鼠以75%乙醇浸泡消毒后，斷頭取腦，置于預(yù)冷的解剖液中，切除小腦、腦干部分，將大腦部分沿矢狀面對(duì)半切開(kāi)，將裸露的腦半球冠狀平面粘附固定于振動(dòng)切片機(jī)載物臺(tái)上。用振動(dòng)切片機(jī)沿冠狀平面切下400μm的腦片若干，轉(zhuǎn)移至盛有預(yù)冷解剖液的培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下分離出海馬組織，轉(zhuǎn)移至Millicell-CM微孔膜上，每個(gè)微孔膜插件放置6個(gè)海馬腦片，將插件置于6孔培養(yǎng)板中，從孔邊緣加入1mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分：25%HBSS＋50%MEM＋25%Horse＋6.5 g/L DGlucose＋25 mM HEPES，pH 7.2～7.4，培養(yǎng)液含雙抗100 U/mL。將6孔培養(yǎng)板置于95%O2、5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后更換培養(yǎng)液，之后每3天更換1次培養(yǎng)液。

2.2腦片生長(zhǎng)形態(tài)觀察腦片培養(yǎng)期間，使用倒置相差顯微鏡對(duì)腦片生長(zhǎng)形態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，并于培養(yǎng)至第1、5、9、13天時(shí)拍照。

2.3分組及OGD損傷模型的建立培養(yǎng)14 d的海馬腦片，分為空白對(duì)照組、OGD 15 min組、OGD 30 min組、OGD 45 min組、OGD 60 min組，每組3孔，每孔3片腦片。OGD各組腦片用PBS漂洗3遍，每孔加入1 m L PBS，移入94%N2、5%CO2、1%O2、37℃的三氣培養(yǎng)箱孵育15、30、45、60 min后，吸棄無(wú)糖培養(yǎng)液PBS，更換為正常培養(yǎng)液1 mL，重新移入95%O2、5%CO237℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。空白對(duì)照組不作任何處理。

2.4PI染色于造模前24 h、造模后1、3、5 d進(jìn)行PI染色。具體方法：每孔加入含50μg/mL PI染液的培養(yǎng)液1 mL，于95%O2、5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況。

2.5LDH檢測(cè)于造模前24 h、造模后1、3、5 d吸取海馬腦片培養(yǎng)液，離心取上清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，用微量酶標(biāo)法測(cè)定腦片培養(yǎng)液上清中的LDH含量。

3　結(jié)果

3.1腦片生長(zhǎng)形態(tài)培養(yǎng)1 d的腦片厚度迅速增加，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，腦片逐漸變薄，由邊緣向中心逐漸變得透亮，組織邊緣界線逐漸模糊，觀察到有細(xì)胞向周圍浸潤(rùn)生長(zhǎng)，海馬結(jié)構(gòu)逐漸變得清晰可見(jiàn)，培養(yǎng)至13 d腦片生長(zhǎng)情況逐漸穩(wěn)定，見(jiàn)圖1。

3.2PI染色情況PI染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組海馬腦片各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)特異性熒光信號(hào)；OGD 15 min組缺氧缺糖1 d后僅可見(jiàn)極微弱熒光信號(hào)，3 d后熒光信號(hào)消失；OGD 30 min組缺氧缺糖1 d后出現(xiàn)弱熒光信號(hào)，3 d熒光信號(hào)有所增強(qiáng)，之后熒光信號(hào)逐漸減弱，提示腦組織可能在輕微損傷后啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制完成自我修復(fù)；OGD 45 min組缺氧缺糖1 d后出現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)，3 d熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，之后熒光強(qiáng)度維持在相對(duì)穩(wěn)定水平；OGD 60 min組缺氧缺糖后出現(xiàn)極強(qiáng)熒光信號(hào)，海馬區(qū)域全部紅染，3 d后熒光信號(hào)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯減弱。

3.3培養(yǎng)液LDH含量檢測(cè)各組海馬腦片缺氧缺糖前培養(yǎng)液LDH釋放量無(wú)明顯差異（P＞0.05），缺氧缺糖后1 d，OGD 15 min、30 min組的LDH釋放量雖較空白對(duì)照組有所增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；OGD 45 min組、60 min組的LDH釋放量明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。在缺氧缺糖后3、5 d各組的LDH釋放量較1 d有所減少，與空白對(duì)照組相比，OGD 15 min、30 min組的LDH釋放量無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）；OGD 45 min組、60 min組的LDH釋放量明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表1、圖2。

表1　不同OGD時(shí)長(zhǎng)對(duì)LDH釋放量的影響

4　討論

4.1對(duì)腦片施加OGD處理，可以模擬腦卒中后腦組織周圍缺氧缺糖的微環(huán)境。海馬是與哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，對(duì)缺血損傷較為敏感，因此海馬腦片尤其適用于缺血性腦損傷的研究［8］。

4.2本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腦片生長(zhǎng)狀態(tài)的動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1 d腦片厚度迅速增加，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，小膠質(zhì)細(xì)胞大量生成，倒置相差顯微鏡下透光性變差。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，腦片逐漸變薄，透光性漸佳，由邊緣向中心逐漸變得透亮，組織邊緣界線逐漸模糊，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，海馬結(jié)構(gòu)逐漸變得清晰可見(jiàn)，可見(jiàn)清晰的CA1、CA3區(qū)域及齒狀回結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)13 d腦片生長(zhǎng)情況逐漸穩(wěn)定，可用于后續(xù)OGD實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的OGD誘導(dǎo)的海馬腦片缺氧缺糖損傷模型主要有浸沒(méi)法、充N2法及三氣培養(yǎng)箱缺氧法等，造模時(shí)長(zhǎng)的選擇更是不盡相同。本課題組在腦片培養(yǎng)技術(shù)成熟的基礎(chǔ)上對(duì)造模時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行相關(guān)探索，實(shí)驗(yàn)采用PI染色熒光和LDH累積釋放量作為觀察和檢測(cè)指標(biāo)，以評(píng)價(jià)不同造模時(shí)長(zhǎng)對(duì)OGD誘導(dǎo)的海馬腦片缺氧缺糖損傷模型的影響。PI是一種細(xì)胞核染色試劑，其無(wú)法穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但可穿過(guò)凋亡或壞死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜與DNA雙鏈結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光［9］。LDH廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞中，其滲出是細(xì)胞受損的標(biāo)志，檢測(cè)LDH的累積釋放量可反應(yīng)腦片的存活狀態(tài)［10］。研究表明，腦片的PI熒光信號(hào)強(qiáng)度和LDH釋放量具有相關(guān)性［11］。

本實(shí)驗(yàn)PI熒光染色結(jié)果顯示，造模前各組均無(wú)紅色熒光信號(hào)，造模后1 d除OGD 15 min組外，其它組均出現(xiàn)強(qiáng)度不一的熒光信號(hào)，且隨著造模時(shí)間的增長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明缺氧缺糖已造成腦片的損傷。造模后3 d，除OGD 15 min組外，其它組熒光信號(hào)均有所增強(qiáng)，推測(cè)此現(xiàn)象為遲發(fā)性的細(xì)胞凋亡或壞死，可能由于海馬腦片無(wú)法準(zhǔn)確地復(fù)制在體腦缺血的神經(jīng)死亡的時(shí)間模式，因此于缺氧缺糖后2～4 d在CA1區(qū)出現(xiàn)了損傷的加劇。造模后 5 d，OGD 30 min組的熒光信號(hào)趨于消失，OGD 45 min組熒光信號(hào)稍有減弱，但仍較為穩(wěn)定，而OGD 60 min組紅色熒光發(fā)散，背景紅染，提示損傷進(jìn)一步加劇。LDH釋放量檢測(cè)結(jié)果顯示，造模前各組LDH累積釋放量無(wú)顯著差異，造模后1 d各OGD組LDH釋放量均有不同程度的增加，且與造模時(shí)間的延長(zhǎng)呈正相關(guān)，其中OGD 45 min組、OGD 60 min組LDH釋放量明顯高于空白組。此后各組仍維持相應(yīng)趨勢(shì)，且能持續(xù)一定時(shí)間。

4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，缺氧缺糖15、30 min不是制備OGD海馬腦片模型的最佳時(shí)長(zhǎng)，最佳時(shí)長(zhǎng)應(yīng)為45 min以上。在本實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到缺氧缺糖60 min的海馬腦片損傷程度較缺氧缺糖45 min的損傷更為嚴(yán)重，表現(xiàn)出無(wú)法恢復(fù)的趨勢(shì)。所以，我們認(rèn)為器官型海馬腦片的OGD誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)以45 min為宜，此模型可用于后續(xù)的腦卒中康復(fù)治療藥物的篩選及作用機(jī)制研究。

［1］陶靜，柳維林，黃佳，等.基于Notch1信號(hào)通路觀察電針對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血周邊皮質(zhì)與SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響［J］.康復(fù)學(xué)報(bào)，2015，25（3）：23-34.

［2］ULLRICH C，DASCHIL N，HUMPEL C.Organotypic vibrosections：Novel whole sagittal brain cultures［J］.Journal of Neuroscience Methods，Elsevier B.V.，2011，201（1）：131－141.

［3］林羽，徐偉，張玉琴，等.栝樓桂枝顆?？谷毖阅X卒中大鼠神經(jīng)元及原代海馬神經(jīng)元凋亡研究［J］.康復(fù)學(xué)報(bào)，2015，25 （1）：38-43.

［4］陳立典，勵(lì)建安.發(fā)展中的中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)［J］.康復(fù)學(xué)報(bào)，2015，25（1）：2-5.

［5］李宏玉，朱路文，唐強(qiáng)，等.早期介入功能性電刺激對(duì)腦梗死足下垂患者下肢運(yùn)動(dòng)功能的影響［J］.康復(fù)學(xué)報(bào)，2015，25（1）：6-9.

［6］謝鴻宇，吳毅.豐富環(huán)境對(duì)腦缺血損傷后功能代償性恢復(fù)的作用［J］.康復(fù)學(xué)報(bào)，2015，25（1）：50-53.

［7］STOPPINI L，BUCHS P-A，MULLER D.A simp le method for organotypic cultures of nervous tissue［J］.Journal of Neuroscience Methods，1991，37（2）：173-182.

［8］M.RENIC，S.N.KUMAR D G.Protective effect of 20-HETE inhibition in a model of oxygen-glucose deprivation in hippocampal slice cultures［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol.，2012，302（6）：1285-1293.

［9］SUN X，YAO H，DOUGLAS R M.InsulinPI3K signaling protects dentate neurons from oxygen-glucose deprivation in organotypic slice cultures［J］.Journal of Neurochemistry，2010，112：377-388.

［10］DIONNE K R，LESER JS，LORENZEN K.A brain slice culture model of viral encephalitis reveals an innate CNS cytokine response profile and the therapeutic potential of caspase inhibition ［J］.Experimental Neurology，Elsevier B.V.，2011，228（2）：222-231.

［11］SRIPATHIRATHAN K，BROWN J，NEAFSEY E J.Linking binge alcohol-induced neurodamage to brain edema and potential aquaporin-4 upregulation：evidence in rat organotypic brain slice cultures and in vivo.［J］.Journal of neurotrauma，2009，26（2）：261-273.

R285.5

A

1000-338X（2016）01-0033-03

2015-10-21

福建省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)資助課題（WZZY201302），福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題（X2014143、X2014127），國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510393019）

楊瀾（1990—），男，2013級(jí)藥理學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥神經(jīng)藥理研究。

黃枚（1966—），女，教授。E-mail：hmei0303@qq.com