丙泊酚抗N-甲基-D-天冬氨酸毒性作用及其與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的關(guān)系??

房德芳，江 山，李小雷，石薷月

(江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇連云港 222006)

丙泊酚是一種靜脈麻醉藥物，被廣泛用于臨床麻醉和鎮(zhèn)靜,并且對心臟、腦等臟器也有一定的保護作用[1-2]，然而對于丙泊酚腦保護的確切作用機制仍不明確。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有著廣泛分布，在神經(jīng)元生長發(fā)育中起著重要作用，并可促進神經(jīng)元損傷后的再生和修復(fù)[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚促進創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能的恢復(fù)可能與促進BDNF的表達相關(guān)[5]。當(dāng)中樞神經(jīng)損傷發(fā)生后，可導(dǎo)致興奮性氨基酸過度釋放，刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度興奮從而誘發(fā)鈣離子(Ca2+)大量內(nèi)流超載，最終引起神經(jīng)元死亡[6-7]。丙泊酚有拮抗NMDA受體的作用，但其作用是否與調(diào)控BNDF的表達有關(guān)仍不清楚。本實驗采用離體海馬腦片損傷模型，觀察海馬CA1區(qū)誘發(fā)電位和BDNF表達的變化，以探討丙泊酚對于NMDA毒性損傷保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與分組 雄性昆明小鼠(徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量20～26 g，隨機分為對照組、損傷組和丙泊酚組(1、5、10 μmol/L)。

1.1.2儀器與試劑 MEZ-8301微電極放大器(日本光電)、SEN-3301刺激器(日本光電)、ZQP-86振動切片機(上海海天電子儀器公司)、HXD-2000處理分析軟件(北京華翔公司)。丙泊酚購自英國AstraZeneca公司，NMDA購自美國Sigma公司，兔多克隆一抗購自美國Santa Cruz公司。人工腦脊液(ACSF)成分及含量(mmol/L)：NaCl 124 mmol/L，KCl 3.3 mmol/L，NaH2PO41.24 mmol/L，MgSO42.4 mmol/L，NaHCO325.7 mmol/L，CaCl22.4 mmol/L，葡萄糖10.0 mmol/L，pH 7.35～7.45。

1.2 方法

1.2.1離體海馬腦片的制備 小鼠麻醉后，斷頭取腦，然后將腦組織置于95% O2與5% CO2混合氣體飽和的ACSF中(0～4 ℃)，使用振動切片機切取厚度為400 μm的海馬腦片(每組10張腦片)，然后將腦片放置在(32.0±0.5)℃的95% O2與5% CO2混合氣體飽和ACSF中孵育和恢復(fù)2～3 h。實驗時將4～5張腦片移入全浸式恒溫灌流槽內(nèi)(32.0±0.5)℃，灌流速度為1.5～2.0 mL/min。

1.2.2實驗程序 NMDA毒性實驗用含NMDA(0.1、0.5、1.0、2,0 mmol/L)的ACSF灌流腦片，20 min后去除NMDA，再用經(jīng)95% O2與5% CO2混合氣體飽和的ACSF灌流，觀察時間至去除NMDA后2 h。實驗組給藥方法：在NMDA使用前15 min，使用中20 min，去除后15 min這段時間內(nèi)將不同濃度的丙泊酚(1、5、10 μmol/L)加入灌流液中。對照組無藥物處理。

1.2.3順向群峰電位(OPS)的記錄 選取灌流槽內(nèi)1張腦片，將刺激電極放置在小鼠海馬腦片CA3區(qū)的Schaffer側(cè)支路徑上，記錄電極為玻璃微電極(內(nèi)充2 mmol/L NaCl溶液，電阻為2～10 MΩ)，置于CA1區(qū)錐體細(xì)胞層，可記錄到誘發(fā)電位。OPS經(jīng)放大后輸入計算機進行數(shù)據(jù)分析。實驗中觀察OPS波幅的變化，直至去除NMDA 2 h后OPS的恢復(fù)情況。

1.2.4腦片組織損傷測定 采用2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法測定。去除NMDA 2 h后，灌流槽內(nèi)的部分腦片用2% TTC染色30 min，漂洗，表面水分用濾紙吸干，腦片稱重后，以1 g∶20 mL的比例加入抽提液(乙醇∶二甲亞砜=1∶1)，避光密閉保存24 h，抽提液按100 μL 的量分別加入96孔板，酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處吸光度值。腦片組織損傷率按以下公式計算：組織損傷百分率=(1-A損傷/A對照)×100%。

1.2.5免疫組織化學(xué)測試 去除NMDA 2 h后，灌流槽內(nèi)部分腦片經(jīng)4%多聚甲醛固定8 h后，用不同濃度的蔗糖進行梯度脫水，連續(xù)海馬冠狀冰凍30 μm切片。采用SP法，切片經(jīng)3%過氧化氫(H2O2)處理消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，沖洗后加羊血清進行封閉處理，然后滴加兔多克隆BDNF一抗(1∶200稀釋)，放置在4 ℃冰箱內(nèi)過夜，沖洗后滴加羊抗兔二抗，37 ℃下孵育1 h，沖洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白霉素工作液，37 ℃下孵育1 h，沖洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，然后貼片、脫水、透明和封片。

1.3觀察指標(biāo) 電生理實驗OPS恢復(fù)幅度：去除NMDA 2 h后OPS波幅與初始OPS波幅的百分比。免疫組織化學(xué)結(jié)果采用圖像分析處理系統(tǒng)進行灰度分析，每張切片在高倍鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞的染色強度，以背景灰度值減去測量處灰度值后的平均值作為最終灰度值。

2 結(jié) 果

2.1NMDA毒性對腦片損傷的影響 在加入NMDA(0.1 mmol/L)后海馬腦片CA1區(qū)OPS振幅增大，并一直維持到去除NMDA 2 h后。在加入NMDA(0.5 mmol/L)后OPS逐漸減小，去除NMDA 2 h后OPS恢復(fù)程度降低，海馬腦片損傷率增加。在加入NMDA(1.0、2.0 mmol/L)后OPS在20 min內(nèi)消失，去除NMDA 2 h后OPS恢復(fù)程度均明顯降低，海馬腦片損傷率明顯增加，見表1。

2.2丙泊酚對NMDA毒性損傷后腦片OPS的影響 在損傷組去除NMDA(1 mmol/L)2 h后海馬腦片CA1區(qū)OPS恢復(fù)程度較低。丙泊酚(5、10 μmol/L)可明顯提高OPS恢復(fù)程度，與損傷組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖1。

2.3丙泊酚對NMDA毒性損傷后腦片組織損傷的影響 在損傷組去除NMDA(1 mmol/L)2 h后海馬腦片損傷率較大。丙泊酚(5、10 μmol/L)可使損傷率明顯降低，與損傷組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 不同濃度NMDA對海馬腦片損傷的影響

*：P<0.05，#：P<0.01，與NMDA(0.1 mmol/L) 比較

A：NMDA損傷前；B：NMDA損傷4 min；C：NMDA損傷20 min；D：NMDA損傷后2 h圖1 NMDA損傷時海馬腦片OPS的變化

2.4丙泊酚對NMDA毒性損傷后腦片BDNF表達的影響 在對照組海馬腦片上CA1區(qū)BDNF陽性細(xì)胞有表達。在損傷組加入NMDA(1 mmol/L)后海馬腦片BDNF陽性細(xì)胞表達略有增高，但與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。丙泊酚(5、10 μmol/L)可使BDNF陽性細(xì)胞表達明顯增多，染色加深，與損傷組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表2、圖2。

表2 丙泊酚對NMDA毒性損傷后海馬腦片損傷率、OPS振幅和BDNF表達的影響

*：P<0.05，#：P<0.01，與損傷組比較；△：P<0.01，與對照組比較

A：對照組；B：丙泊酚組(10 μmol/L)；C：損傷組圖2 NMDA損傷時海馬腦片BDNF表達的變(化SP法×200)

3 討 論

在離體海馬腦片上，當(dāng)電刺激CA3錐體細(xì)胞發(fā)出的Schaffer側(cè)枝纖維時，通過突觸傳遞，可在CA1錐體細(xì)胞層記錄到順向誘發(fā)的場電位，即OPS。海馬CA1區(qū)是腦損傷的敏感區(qū)域，而損傷后OPS的振幅值大小代表突觸傳遞功能的恢復(fù)程度[8-9]。實驗中在灌流液中加入濃度為0.1 mmol/L NMDA后海馬CA1區(qū)OPS振幅增加，提示激動NMDA受體，產(chǎn)生興奮神經(jīng)元作用。隨著NMDA濃度增加，過度激動NMDA受體，轉(zhuǎn)而抑制腦片神經(jīng)元的OPS，去除NMDA后，腦片組織有明顯損傷，OPS恢復(fù)程度低，提示對突觸傳遞產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)而表現(xiàn)毒性作用。

丙泊酚作為全身麻醉藥物主要通過抑制中樞的興奮性突觸傳導(dǎo)和(或)加強抑制性突觸傳遞而發(fā)揮麻醉作用[10]。有研究表明，丙泊酚通過激活抑制性γ-氨基丁酸受體(GABAA受體)影響離子型NMDA受體通道電流，對NMDA受體通道也有直接抑制作用[11-12]，丙泊酚可通過抑制NDMA受體，從而保護神經(jīng)細(xì)胞。本實驗中丙泊酚可明顯減輕腦片組織損傷，提高海馬CA1區(qū)OPS恢復(fù)程度，提示丙泊酚可拮抗NMDA誘導(dǎo)的興奮性毒性作用，從而減輕細(xì)胞損傷，有利于突觸傳遞功能的恢復(fù)。

有研究表明，BDNF可增強海馬突觸后NMDA受體的磷酸化，迅速增加神經(jīng)元之間的突觸傳遞[13]。在腦損傷發(fā)生時可導(dǎo)致BDNF的表達廣泛增加，而且腦組織抵抗損傷的能力與BDNF表達水平呈正相關(guān)[14-15]。在實驗中NMDA可使海馬腦片CA1區(qū)BDNF表達增強，說明當(dāng)神經(jīng)元受到外來因素?fù)p傷時BDNF水平提高是一種保護性反應(yīng)。丙泊酚可使BDNF表達明顯增強，從而提高腦內(nèi)BDNF的表達尤其是腦內(nèi)易損區(qū)的BDNF表達，可能是其保護作用的重要途徑之一。

當(dāng)細(xì)胞外液中NMDA水平持續(xù)增高，構(gòu)成NMDA毒性環(huán)境，造成細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞間的突觸傳遞，而此時細(xì)胞的自我保護機制亦啟動，BDNF的表達開始增加。本實驗結(jié)果提示，丙泊酚可通過增強BDNF的表達，減輕神經(jīng)元的損傷，使得神經(jīng)突觸之間的連接保持正常，從而促進突觸傳遞效能的恢復(fù)。