UPLC-MS／MS 法同時測定酸棗安神顆粒中15 種成分

李葆林 郄蘭霞王鑫國牛麗穎*

（1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊050091； 2.河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊050091；3.中藥材品質(zhì)評價與標(biāo)準(zhǔn)化河北省工程研究中心，河北 石家莊050091； 4.石家莊市第五醫(yī)院，河北石家莊050024）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow 的干燥成熟種子，主產(chǎn)于河北、陜西、遼寧、河南等地，具有養(yǎng)肝、寧心、安神、斂汗之功效［1-3］，相關(guān)市售制劑達(dá)數(shù)十種之多。課題組前期自主研發(fā)了以酸棗仁為君藥，配伍茯苓、桑葚、黃精、枸杞、佛手等藥材的酸棗安神顆粒，優(yōu)化了其處方及制備工藝，并建立了質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本實驗在此基礎(chǔ)上，采用UPLC-MS／MS 法同時測定酸棗安神顆粒中柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Q-Triple 4500 MS／MS System（美國AB SCIEX 公司）；TB-215D 電子天平（十萬分之一）、BSA224S-CW 電子天平（萬分之一）（德國賽多利斯公司）；KQ-250 型超聲波清洗器（功率250 W、頻率40 kHz）（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸對照品（純度99.96%，批號PY20170216）購自南京普怡生物科技有限公司；槲皮素（純度97.3%，批號100081-200406）、異槲皮苷（純度97.2%，批號111809-201804）、阿魏酸（純度99%，批號110773-201614）、咖啡酸（純度98%，批號110885-200102）、芹菜素（純度99.6%，批號111901-201102）、沒食子酸（純度90.8%，批號110831-201605）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮苷（純度98%，批號151009）、山柰酚（純度98%，批號130708）對照品均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；新綠原酸（純度98%，批號MUST-12113001）、隱綠原酸（純度98%，批號MUST-13013002）、紫云英苷（純度98.81%，純度MUST-16030810）對照品均購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司中國科學(xué)院成都生物研究所；異綠原酸A（純度99%，批號DST-180130-037）、異綠原酸B（純度99.05%，批號DST180130-037）、異綠原酸C（純度99.84%，批號DST180210-038）對照品均購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司。酸棗安神顆粒（自制，批號20200811、20200812、20200813）。乙 腈、甲醇、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸對照品適量，甲醇制成貯備液，吸取適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為8.32、56.06、14.72、12.45、2.20、1.02、1.71、6.23、11.13、3.65、4.17、71.71、2.13、0.52、3.98 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 取本品約0.5 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取15 min，冷卻至室溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 LC-MS 分析條件

2.2.1 色譜 Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～5 min，7% A；5～15 min，7%～45% A；15～20 min，45% A；20～33 min，45%～90%A；33～34 min，90%A；34.1～40 min，7%A）；體積流量0.4 μL／min；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL。MRM 色譜圖見圖1。

圖1 各成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），負(fù)離子模式；源噴射電壓（IS）-4 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣（GS1）50 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；輔助氣（GS2）50 psi；氣簾氣（CUR）40 psi，其他參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 線性關(guān)系考察 將“2.1”項下對照品溶液逐級稀釋2、4、10、20、200倍，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并分別以信噪比（S／N）10、3 為定量限（LOQ）、檢測限（LOD），結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度試驗 取同一份稀釋20 倍的對照品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定6次，測得柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸峰面積RSD 分別為2.79%、2.09%、1.99%、1.98%、1.68%、1.94%、2.25%、2.88%、1.58%、2.27%、2.19%、1.62%、1.58%、2.78%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批本品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、18 h 在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸峰面積RSD 分別為1.61%、1.84%、1.76%、2.25%、2.08%、1.74%、2.39%、2.64%、2.83%、2.29%、2.50%、1.88%、1.52%、2.33%、2.36%，表明溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批本品，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸含量RSD 分別為2.85%、1.93%、1.11%、2.19%、2.17%、2.59%、2.76%、2.01%、1.96%、2.83%、2.82%、2.56%、2.65%、2.89%、1.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的同一批本品約0.25 g，分別加入高、中、低水平對照品溶液，每個水平平行3份，共9份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸平均加樣回收率分別為 98.90%、98.57%、100.66%、98.96%、98.63%、101.46%、98.81%、101.22%、98.26%、98.77%、102.68%、98.43%、97.92%、102.04%、98.78%，RSD 分別為1.90%、1.99%、2.57%、1.62%、1.52%、2.77%、1.20%、1.67%、1.43%、2.16%、2.29%、2.16%、2.33%、2.86%、2.47%。

2.8 樣品含量測定 取3 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（μg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 參照2020 年版《中國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)，課題組前期考察了斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷、木蘭花堿、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、5-羥甲基糠醛、白樺脂酸、白樺脂醇、槲皮苷等31 種成分［4-20］，并且已采用HPLC 法測定了斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷、木蘭花堿含量，發(fā)現(xiàn)介于0.114 9～0.297 8 mg／g 之間［21］?？紤]到酸棗安神顆粒中各成分含量限度，結(jié)合方法學(xué)考察情況，最終選擇15 種成分作為指標(biāo)，其中柚皮苷、芹菜素來源于酸棗仁，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、異槲皮苷、紫云英苷、沒食子酸來源于桑葚，槲皮素、山柰酚來源于黃精，阿魏酸、咖啡酸來源于枸杞。

3.2 流動相選擇 本實驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸，發(fā)現(xiàn)以乙腈-甲酸洗脫時各成分分離度、峰形、出峰時間較好，故選擇其作為流動相。

4 結(jié)論

酸棗安神顆粒藥味較多，成分復(fù)雜，本實驗建立UPLC-MS／MS 法同時測定該制劑中柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸的含量，該方法簡便、穩(wěn)定、可靠，可其質(zhì)量控制提供參考。