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    九龍?zhí)倏傸S酮通過lncRNA MIAT 調(diào)控自噬對大鼠急性心肌梗死的影響

    2022-07-18 10:33:28陳卉彬
    醫(yī)學(xué)信息 2022年13期
    關(guān)鍵詞:透射電鏡造模批號

    陳卉彬,簡 潔

    (桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西 桂林 541199)

    急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠狀動脈急性、延續(xù)性缺血和缺氧所致的心肌壞死,為臨床常見的突發(fā)疾病,其死亡率較高[1]?,F(xiàn)如今中醫(yī)藥對AMI 有良好的治療效果[2],但對現(xiàn)有藥物的研究大多停留在藥效階段,缺乏對其作用靶點及分子機制的深入探討。九龍?zhí)贋槎箍浦参稞堩毺賉Bauhinia championii(Benth.)Benth.]的干燥根或莖,含有豐富的黃酮類化合物,其提取物的藥理作用主要體現(xiàn)在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝血等方面[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)[4-7],九龍?zhí)倏傸S酮(Bauhinia Championii flavone,BCF)對垂體后葉素所導(dǎo)致的急性心肌缺血有保護作用,可激活PI3K/Akt 信號通路抗心肌缺血/再灌注損傷,并抑制自噬,減輕心肌細(xì)胞缺血/缺氧損傷。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過20 個核苷酸、缺乏蛋白質(zhì)編碼潛能的內(nèi)源性RNA分子。lncRNA 在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-11]。研究表明[12],被稱為心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(Myocardial infarction associated transcript,MIAT)的lncRNA 可能在心肌梗死的發(fā)病機制中發(fā)揮部分作用。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)[13],敲低MIAT 表達(dá)可影響自噬,從而保護CCA 誘導(dǎo)的心肌肥厚,因而推測BCF 的保護作用與調(diào)節(jié)MIAT 表達(dá)抑制自噬有關(guān)。本研究通過建立大鼠心梗模型探討B(tài)CF 通過MIAT 調(diào)控自噬對AMI 的影響,以期為防治AMI新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠50 只,體重為200~240 g,由湖南斯萊克景達(dá)動物有限公司提供[許可證號碼:SCKX(湘)2019-0004]。于桂林醫(yī)學(xué)院藥理教研室分籠飼養(yǎng),溫度24 ℃~26 ℃,濕度50%~60%,12 h/12 h 明暗周期,自由進食和飲水。

    1.2 材料 BCF(本室分離純化,總黃酮含量以蘆丁計為85%);戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥工業(yè)公司上海第八制藥工廠,批號:71C805);Gluta 固定液(北京索萊寶有限公司,批號:20220209);Trizol 試劑(北京天根公司,批號:W0222);EasyScript ○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司,批號:O11208);Perfect-StartTM Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司,批號:P41014);大鼠cTn-Ⅰ試劑盒(武漢華美生物公司,批號:Z21019821);所有引物購自上海生工生物工程股份有限公司;GAPDH和Cathepsin D 抗體(Proteintech Group,批號:10020246、00058789);LC3 抗體(Elabscience,批號:DQ0262);超微量核酸定量儀(Thermo Scientific,型號:NanoDrop One);實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad,型號:CFX96TM Real-Time System);免疫印跡化成像系統(tǒng)(Bio-Rad,型號:ChemiDocTMXRS+);小動物呼吸機(美國CEW 公司,型號:SAR-1000)。

    1.3 方法

    1.3.1 動物分組 隨機選取雄性SD 大鼠,分為sham 組、AMI 組、BCF 組,除假手術(shù)組外,其余各組采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備大鼠心肌缺血模型,缺血24 h 后進行l(wèi)nc RNA 基因檢測。設(shè)計并合成lnc RNA MIAT si-RNA,將雄性SD 大鼠分為si-NC 組、si-MIAT 組、BCF+si-NC 組和BCF+si-MIAT 組,按實驗分組制備大鼠心肌缺血模型(缺血24 h)。si-NC、si-MIAT、BCF+si-NC、BCF+si-MIAT 組于造模前24 h 心肌注射MIAT 及其對照(NC)si-RNA 進行轉(zhuǎn)染,BCF、BCF+si-NC、BCF+si-MIAT 組于造模前30 min 給予BCF(20 mg/kg)預(yù)處理。

    1.3.2 HE 染色 造模結(jié)束后,心臟用4%多聚甲醛固定,通過梯度濃度的酒精脫水并嵌入石蠟中包埋。將包埋好的組織切成5 μm 厚的切片,在二甲苯中脫蠟,然后重新脫水,隨后進行HE 染色。應(yīng)用正置顯微鏡觀察切片。

    1.3.3 血清cTn-Ⅰ含量測定 造模結(jié)束,各組動物經(jīng)心尖取血1 ml,10 000 r/min 離心20 min,取上清液,按大鼠cTn-Ⅰ試劑盒說明書檢測血清中cTn-Ⅰ含量。

    1.3.4 透射電鏡 取動物心臟組織,用預(yù)冷的PBS 沖洗,切成2 mm 的立方體,4 ℃下固定過夜。乙醇梯度脫水后,進行包埋固化,隨后將組織切片為90~100 nm 厚的薄片。組織染色后安裝在200 目銅絲上,用JEM1200EX 透射電鏡進行成像。

    1.3.5 RT-qPCR 用Trizol 試劑從組織中提取總RNA,合成第一鏈cDNA。按照SYBR Green QPCR Master Mix 說明書進行PCR 定量。數(shù)據(jù)分析采用GAPDH 作對照基因,2-△△CT方法計算基因表達(dá)量,引物序列見表1。

    1.3.6 Western blot 各組動物在造模結(jié)束后取心臟,用預(yù)冷的生理鹽水充分洗凈殘血,取結(jié)扎線以下左心室組織,用RIPA(北京索萊寶公司)裂解總蛋白并定量,SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜橫流260 mA,5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4 ℃過夜,二抗室溫孵育1 h,ECL 發(fā)光,采用Image J 軟件測其灰度值。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素分析,組內(nèi)比較采用t檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MIAT 在AMI 大鼠中的表達(dá)情況 AMI 組MIAT表達(dá)高于Sham 組,而AMI+BCF 組MIAT 表達(dá)低于AMI 組(P<0.05),見圖1。

    圖1 MIAT 在AMI 大鼠中的表達(dá)情況

    2.2 各組大鼠心臟組織HE 染色結(jié)果分析 AMI+si-NC 組的心肌細(xì)胞減少且肥大,心肌纖維斷裂且散亂排列,細(xì)胞間隙變寬;與AMI+si-NC 組比較,AMI+si-MIAT 組和AMI+BCF+si-NC 組細(xì)胞心肌細(xì)胞程度肥大減輕,排列較整齊。同時,AMI+BCF+si-MIAT組病理變化較AMI+BCF+si-NC 組有一定程度的改善,見圖2。

    圖2 各組大鼠心臟組織的HE 染色結(jié)果(×400)

    2.3 各組血清cTn-Ⅰ含量比較 AMI+si-MIAT 組、AMI+BCF+si-NC 組 和AMI+BCF+si-MIAT 血 清cTn-Ⅰ含量低于AMI+si-NC 組(P<0.05);同時,AMI+BCF+si-MIAT 組血清cTn-Ⅰ含量低于AMI+BCF+si-NC 組(P<0.05),見圖3。

    圖3 各組大鼠血清中cTn-Ⅰ含量比較

    2.4 各組大鼠心臟組織自噬小體透射電鏡結(jié)果分析AMI+si-NC 組自噬小體數(shù)量高于AMI+si-MIAT 組和AMI+BCF+si-NC 組,且相較于AMI+BCF+si-NC組,AMI+BCF+si-MIAT 組自噬小體的數(shù)量也有所減少,見圖4。

    圖4 各組大鼠心臟組織自噬小體透射電鏡結(jié)果(×20 000)

    2.5 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)基因表達(dá)比較 AMI+si-NC 組Beclin1、Cathepsin D、LC3 表達(dá)高于AMI+si-MIAT 組、AMI+BCF+si-NC 組、AMI+BCF+si-MIAT 組(P<0.05);而AMI+BCF+si-MIAT 組Beclin1、Cathepsin D、LC3 表達(dá)低于AMI+BCF+si-NC 組(P<0.05),見圖5。

    圖5 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)基因表達(dá)比較

    2.6 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 AMI+si-NC 組Beclin1、Cathepsin D、LC3 的蛋白表達(dá)高于AMI+si-MIAT 組、AMI+BCF+si-NC 組、AMI+BCF+si-MIAT 組(P<0.05);而AMI+BCF+si-MIAT組Beclin1、Cathepsin D、LC3 的蛋白表達(dá)低于AMI+BCF+si-NC 組(P<0.05),見圖6。

    圖6 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

    3 討論

    AMI 是一種可由缺血性心臟病或冠狀動脈疾病共同引起的疾病,當(dāng)動脈粥樣硬化斑塊破裂,形成的血凝塊完全或部分堵塞冠狀動脈,限制了流向心臟的血液時,AMI 就會發(fā)生并伴有心源性休克等并發(fā)癥,病情險惡、死亡率高[14]。在臨床上,通常通過手術(shù)或冠狀動脈介入來疏通堵塞的血管,以恢復(fù)心臟的血流,但由此產(chǎn)生的缺血再灌注損傷和手術(shù)并發(fā)癥限制了治療的整體效果。因此,需要采取有效的治療方法。

    據(jù)報道[15],中藥會影響血小板聚集、循環(huán)、氧化應(yīng)激、血管反應(yīng)性和其他心血管特性。中藥也在AMI的治療中積累了豐富的經(jīng)驗。白曉君等[16]研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿總黃酮可以PI3K/Akt/VEGF 細(xì)胞信號通路促進缺血性心肌的血管再生。九龍?zhí)偈菑V西的特色中藥材,其性平、無毒、資源豐富,含有豐富的黃酮類化合物和皂甙,具有祛風(fēng)除濕、化瘀、活血、止痛等作用。本課題組前期實驗也表明[4],BCF 對垂體后葉素所致的急性心肌缺血具有明顯的保護作用。另有研究表明[17-20],lncRNA 在心衰、心肌肥大、心肌缺血/再灌注損傷等心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。lncRNA MIAT 是一種跨物種的lncRNA,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肺和脾臟中表達(dá),被認(rèn)為在多種疾病中發(fā)揮重要作用[21]。有報道稱[22],MIAT 的表達(dá)在缺氧細(xì)胞中上升,并與SF1 結(jié)合,抑制CGRP 的轉(zhuǎn)錄,促進細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致AMI。同時,它還是臨床診斷急性心肌梗死的潛在新生物標(biāo)志物[23]。本研究建立了動物AMI 模型,RT-qPCR 檢測心臟組織中MIAT 的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的心肌梗死模型中,MIAT 表達(dá)上調(diào),BCF 預(yù)處理可下調(diào)缺血心肌MIAT 基因水平。同時,沉默MIAT 與BCF 預(yù)處理可降低血清中的心肌缺血損傷的標(biāo)志物cTn-Ⅰ含量,從而減輕AMI。自噬是一種代謝過程,老化或受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被分解成氨基酸和脂肪酸,用于能量生產(chǎn)和回收[24,25]。它響應(yīng)于營養(yǎng)缺乏或代謝應(yīng)激而被激活,以維持組織功能和體內(nèi)平衡[26]。許多研究已經(jīng)揭示了自噬在AMI 中的功能,心臟自噬的過度激活會對急性心肌梗塞產(chǎn)生不良影響[27]。因此,抑制自噬可能是治療缺血性心臟病的一個策略。實驗也表明[9],BCF 通過抑制自噬,改善心肌缺血損傷。本研究結(jié)果顯示,沉默MIAT 可促進BCF 對自噬的抑制作用,如減少自噬小體的數(shù)量、下調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ比率和Beclin1、Cathepsin D 的表達(dá),可見BCF 通過介導(dǎo)MIAT 影響AMI 誘導(dǎo)的自噬。

    綜上所述,BCF 預(yù)處理下調(diào)MIAT 基因表達(dá),提示MIAT 是BCF 治療心臟AMI 的潛在靶點。

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