胡桃醌通過(guò)促進(jìn)c-Myc泛素化降解抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡

c-Myc是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡發(fā)揮重要重要作用。研究表明c-Myc作為轉(zhuǎn)錄中心的作用，其可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)某些miRNA 的表達(dá)，而這些miRNA為調(diào)節(jié)性小RNA家族，通過(guò)靶向蛋白質(zhì)編碼基因發(fā)揮作用。泛素（Ub）是含有76 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)E1-E2-E3 級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳遞至底物蛋白介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素化。在真核細(xì)胞中，泛素化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它可以通過(guò)26 S 蛋白酶體介導(dǎo)底物蛋白的降解，或者調(diào)節(jié)底物蛋白的生物學(xué)功能。有研究表明冬凌草甲素可通過(guò)促發(fā)FBW7介導(dǎo)的c-Myc蛋白酶體降解過(guò)程抑制白血病細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。

有研究表面，胡桃醌具有體外抗腫瘤的作用，例如胃癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等。本課題組前期研究表明胡桃醌可抑制宮頸癌細(xì)胞得增殖并促進(jìn)其凋亡，而其機(jī)制尤其是對(duì)c-Myc蛋白的影響尚不清楚，故本研究擬在針對(duì)性研究胡桃醌對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc蛋白泛素化降解的影響旨在為胡桃醌作為靶向藥物，為宮頸癌的治療提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞系來(lái)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，保存于吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)液用Penicillin-Streptomycin Solution、胎牛血清與 Dulbecco's Modified Eagle Medium 培養(yǎng)基均來(lái)自杭州四季青公司，并按1∶10∶100配制。周期與凋亡試劑盒（碧云天）；胡桃醌和溴化四氮唑藍(lán)（MTT，Sigma）。各類單克隆抗體以及二抗（Santa Cruz）。MOTIC AE31顯微鏡（北京汗盟紫星儀器儀表有限公司）；伯樂(lè)-550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）。

1.1 RNA干擾試驗(yàn)

c-Myc敲低細(xì)胞株購(gòu)自長(zhǎng)春潤(rùn)一生物有限公司。構(gòu)建的3條c-Myc干擾序列：1：5'-GAGGGTCAAGTT GGACAGTGT-3'；2：5'-AAACACAAACTTGAACAG CTA-3'；3：5'-CTGCGACGAGGAGGAGAACTT-3'。含有si c-Myc基因通過(guò)Lip 2000試劑盒（Invitrogen）加入到無(wú)青鏈霉素的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)6 h后，換成完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，Western bolt檢測(cè)細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)情況。

(1)大學(xué)生網(wǎng)絡(luò)借貸的影響因素分析。將大學(xué)生的性別、年級(jí)、專業(yè)類型、每月生活費(fèi)和家庭年收入作為相關(guān)因素，對(duì)大學(xué)生是否使用過(guò)網(wǎng)絡(luò)借貸平臺(tái)進(jìn)行l(wèi)ogistics回歸分析。得到結(jié)果如表1：

1.2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞分成4 組：空載體組（si-NC）；胡桃醌組（空載體加20 μmol/L 胡桃醌處理）；si-cMyc 組（轉(zhuǎn)染Myc RNA）；si-cMyc20 μmol/L胡桃醌組（轉(zhuǎn)染Myc RNA加20 μmol/L胡桃醌處理）。24 h后的4組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管在1000離心4 min，離心后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，在培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞懸液及一定量培養(yǎng)液，以5×10/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將配制好胡桃醌以20 μmol/L的濃度干預(yù)24 h 后，5 g/L 的MTT 以每孔20 μL 孵育4 h，DMSO 溶解藍(lán)紫色結(jié)晶在490 nm 測(cè)定吸光度（）值。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞處理及分組情況同1.2，細(xì)胞用消化后離心，用1 mL冰浴的PBS緩沖液重懸離心后加入70%乙醇固定30 min。固定好的細(xì)胞用PBS緩沖液再次離心去上清，將事先配制好保存于4 ℃條件下的的碘化丙啶（PI）染色液以每管0.5 mL加入細(xì)胞樣品染色30 min，此過(guò)程需要溫浴，并避光，染色完成后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP）

與對(duì)照組相比，不同濃度的胡桃醌可降低c-Myc蛋白水平，而圖1B示20 μmol/L胡桃醌處理12 h后c-Myc蛋白水平下調(diào)，在12 h更加顯著（＜0.01，圖1A）。

研究在不同射擊工況下的彈丸膛內(nèi)運(yùn)動(dòng)規(guī)律，對(duì)彈丸裝藥的設(shè)計(jì)和彈炮匹配性設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義，未來(lái)將對(duì)不同磨損程度的身管內(nèi)彈丸運(yùn)動(dòng)規(guī)律作進(jìn)一步的研究。

1.5 泛素化實(shí)驗(yàn)

胡桃醌可下調(diào)c-Myc 的表達(dá)，但加入0.5、1.0、2.0 μmol/L的MG132后即可逆轉(zhuǎn)胡桃醌對(duì)的c-Myc下調(diào)作用，而1.0 μmol/L更加顯著（＜0.05，＜0.01），穩(wěn)定了c-Myc蛋白的表達(dá)（圖3）。

1.6 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

與對(duì)照組相比，HA-Ub轉(zhuǎn)染組存在c-Myc泛素化修飾，而以胡桃醌處理后可明顯增強(qiáng)c-Myc的泛素化水平（圖4）。

正向引導(dǎo)，克服對(duì)手機(jī)的過(guò)度依賴，樹立抵制上課使用手機(jī)的自覺意識(shí) 大學(xué)生是一個(gè)容易接受新鮮事物的群體，處于“三觀”形成的關(guān)鍵時(shí)期?？梢酝ㄟ^(guò)主題團(tuán)日活動(dòng)、專題演講、專題教育活動(dòng)等形式，正向引導(dǎo)學(xué)生，克服對(duì)手機(jī)的過(guò)度依賴，意識(shí)到隨時(shí)隨地使用手機(jī)是一個(gè)“問(wèn)題習(xí)慣”，讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到上課使用手機(jī)弊大于利，是對(duì)教師不尊重、對(duì)家長(zhǎng)和自己不負(fù)責(zé)的行為，讓學(xué)生牢固樹立抵制上課使用手機(jī)的自覺意識(shí)[8]，養(yǎng)成良好的手機(jī)使用習(xí)慣來(lái)減少上課不合理使用手機(jī)的行為。

1.7 CHX脈沖追蹤測(cè)定目的蛋白表達(dá)

Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)入干擾RNA 后蛋白表達(dá)，3種干擾RNA 均降低，以第3 種更為顯著（圖5A、B），故選折第3 種干擾RNA 做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT結(jié)果顯示，與未敲除組（：0.89±0.15）相比，20 μmol/L胡桃醌可明顯降低細(xì)胞增殖（：0.34±0.08，＜0.01），而敲除c-MyC基因后明顯消減了胡桃醌對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制（：0.57±0.05，＜0.05，圖5C）。圖5D、E流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明與未敲除組（早期凋亡率：2.56±0.24）相比，20 μmol/L胡桃醌可明顯升高細(xì)胞早期凋亡率（早期凋亡率：18.45±3.53，＜0.01），而敲除c-MyC基因后明顯消減了胡桃醌對(duì)HeLa細(xì)胞促凋亡活性，（早期凋亡率：11.34±5.34，＜0.05）.

爪極永磁式交流測(cè)速電機(jī)的永磁轉(zhuǎn)子軸向充磁，磁極的極性用N和S表示；導(dǎo)磁爪有6個(gè)：上爪極(白色)A、C、E和下爪極(黑色)B、D、F。永磁轉(zhuǎn)子N極、導(dǎo)磁爪A、導(dǎo)磁爪D、永磁轉(zhuǎn)子S極構(gòu)成磁回路，如圖2(a)所示，磁場(chǎng)方向垂直于紙面；生成的感應(yīng)電動(dòng)勢(shì)按照正弦規(guī)律變化，如圖2(b)所示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因數(shù)方差分析，組間兩兩比較采用SNK-檢驗(yàn)。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胡桃醌對(duì)HeLa細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)的影響

生長(zhǎng)狀態(tài)較好的HeLa細(xì)胞以6×10/孔的密度接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體與目的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后加入MG132 孵育4h。棄去培養(yǎng)基，后用PBS 清洗1次，加入1 mL RIPA 緩沖液，移液槍吹打細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上裂解30 min，每隔10 min震蕩1次。4℃離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，每個(gè)樣品取50 μL 上清混合10 μL6×上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min作為樣品，在剩余上清中每管加入加入20 μL 預(yù)處理的蛋白質(zhì)A/G 瓊脂糖，4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。5000 r/min，4 ℃離心2 min，棄上清，加入1 mL PBS清洗3次，收集磁珠。向余下的磁珠中加入50 μL上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min，先瞬離后震蕩離心，得到的樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

2.2 胡桃醌對(duì)c-Myc蛋白泛素化降解的影響

與對(duì)照組相比，在CHX存在情況下，胡桃醌可明顯縮短c-Myc的半衰期；CHX作用8 h后胡桃醌誘導(dǎo)的c-Myc發(fā)生明顯下降（＜0.01，圖2A、B）。

2.3 蛋白酶體抑制顯著抑制胡桃醌對(duì)c-Myc蛋白的下調(diào)影響

將HeLa 細(xì)胞鋪入六孔板中，使細(xì)胞16～18 h后密度達(dá)到50%～60%。用Lip2000 轉(zhuǎn)染的方法將2.5 μg Flag-Ub，24 h后再以20 μmol/L處理24 h，后加1.0 μmol/L MG132抑制蛋白降解，再過(guò)4 h后收樣。收樣之后用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，用HA抗體去檢測(cè)c-Myc的泛素化條帶。

2.4 胡桃醌通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑促進(jìn)c-Myc蛋白降解

收集培養(yǎng)的細(xì)胞并用冷PBS 緩沖液洗滌后加入裂解緩沖液裂解細(xì)胞，整個(gè)裂解過(guò)程需要10 min，在1.2×10g 離心10 min，檢測(cè)上清濃度，取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)膜。室溫下，PVDF在5%非脂肪牛乳中封閉膜2 h，加入Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和PARP（1∶5000），β-actin（1∶1000）一抗，在4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。第2天用TBST洗滌，以1∶10 000稀釋度將膜與二抗在室溫避光條件下孵育2 h，加底物發(fā)光并拍照。

2.5 敲除c-Myc后用胡桃醌處理對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及凋亡的影響

將處于生長(zhǎng)狀態(tài)較好的HeLa細(xì)胞接種于24孔板，接種密度使第2天生長(zhǎng)到70%～80%左右，后以10、20、50 μmol/L處理12 h。將1 g CHX溶解于10 mL DMSO，將其配制成100 mg/mL母液，于細(xì)胞中加入100 mg/mL母液使其終濃度為10～20 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、2、4、8、12 h 分別裂解細(xì)胞使用Western blot法檢測(cè)c-MyC蛋白降解情況。

3 討論

本研究中，我們分析并確定了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子c-Myc是胡桃醌的分子靶標(biāo)。研究表明，c-Myc在細(xì)胞增殖過(guò)程中具有雙重作用，因?yàn)樗纯梢源龠M(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果顯示抑制c-Myc表達(dá)的抑制可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢并促進(jìn)其凋亡（圖5B、C），這表明c-Myc是與宮頸癌致癌相關(guān)。由于其致癌特性，c-Myc已被證明作為癌癥治療的有效靶標(biāo)。故目前正在進(jìn)行包括使用反義寡核苷酸、siRNA、小分子和天然化合物等旨在靶向c-Myc治療癌癥的策略，在這些方法中，天然化合物由于其強(qiáng)大的抗癌活性和相對(duì)安全性，近年來(lái)受到了特別的關(guān)注。例如，作為天然化合物的冬凌夏草及姜黃素靶向c-Myc 并表現(xiàn)出抗癌活性。然而，研究天然化合物靶向c-Myc的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。本研究表明不同胡桃醌處理HeLa細(xì)胞后可降低c-Myc蛋白質(zhì)水平，而敲除c-myc后可消減其對(duì)HeLa增殖抑制作用。

數(shù)控維修專業(yè)數(shù)字化課程的建設(shè)要需要遵循一定的藝術(shù)性，其中的圖片、文字、聲音和視頻等都要合理運(yùn)用，要能夠?qū)⒅R(shí)進(jìn)行靈活生動(dòng)地呈現(xiàn)，并且符合教學(xué)主題。數(shù)字化教學(xué)平臺(tái)要合理設(shè)計(jì)與布局，導(dǎo)航要簡(jiǎn)單清楚，色彩搭配也要合理，風(fēng)格和諧統(tǒng)一，讓學(xué)生在學(xué)習(xí)時(shí)產(chǎn)生視覺享受。通過(guò)藝術(shù)性的建設(shè)可以吸引學(xué)生注意力，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，使其能夠全身心地參與到教學(xué)活動(dòng)中。

由于蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的執(zhí)行者，所以促進(jìn)c-Myc蛋白的降解可能比下調(diào)c-Myc表達(dá)的策略更有效。蛋白質(zhì)的降解有溶酶體和蛋白酶體兩種途徑，泛素-蛋白酶體途徑是維持細(xì)胞中蛋白穩(wěn)態(tài)的重要途徑之一。泛素分子通過(guò)E1泛素活化酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶與靶蛋白結(jié)合，經(jīng)由泛素-蛋白酶體通路吞噬、降解靶蛋白。我們用不同濃度的蛋白酶體抑制劑MG132與胡桃醌聯(lián)合使用結(jié)果顯示，抑制劑可逆轉(zhuǎn)胡桃醌對(duì)c-Myc蛋白下調(diào)作用，說(shuō)明泛素蛋白酶體依賴性途徑參與了胡桃醌誘導(dǎo)的c-Myc蛋白下調(diào)過(guò)程。

統(tǒng)計(jì)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雷米普利組干咳者6例，占有率為：16.22%，頭暈者4例，占有率為10.81%，總的不良反應(yīng)發(fā)生率為：27.03%，替米沙坦組輕微咳嗽者1例，占有率為2.70%，頭暈者1例，占有率為2.70%，總的不良反應(yīng)發(fā)生率為：5.40%，替米沙坦組的不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于雷米普利組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

研究表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)不同細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的豐度方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在許多類型的癌癥中都觀察到了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的失調(diào)，并且正在開展針對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行癌癥治療的研究。而本次針對(duì)對(duì)c-Myc蛋白泛素化水平檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可增強(qiáng)其泛素化降解水平。

然而蛋白酶體降解有2 個(gè)限速步驟：其一為底物蛋白的特異性修飾，例如磷酸化，以及泛素與底物蛋白的酶促連接。在這項(xiàng)研究中，我們只證明胡桃醌可通過(guò)蛋白酶體途徑促進(jìn)c-Myc的降解，但其機(jī)制需進(jìn)一步探討。