JAG1影響血管生成并促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附

三陰性乳腺癌（TNBC）患者得益于早期篩查和聯(lián)合治療，5年生存率得到了顯著提高，但由于TNBC與其他類型乳腺癌相比，其更容易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且不能從內(nèi)分泌或分子靶向治療中獲益，四期TNBC患者的5年生存率僅為28%左右。TNBC較高的血管密度為腫瘤生長提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)其惡性進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移，因此靶向血管生成可能是其治療的突破口之一。目前TNBC抗血管治療主要以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）信號通路為靶點(diǎn)，代表藥物有貝伐單抗、阿帕替尼等，但臨床試驗(yàn)顯示，用藥后TNBC患者的總生存期（OS）無明顯改善，并且由于替代性促血管生成因子的上調(diào)，耐藥也成為抗血管治療的重要挑戰(zhàn)。關(guān)于腫瘤血管生成，目前較為明確的是VEGF和DLL4/Notch1信號通路。Notch信號在進(jìn)化過程中較為保守，幾乎在所有器官中表達(dá)，協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖、分化和凋亡，決定細(xì)胞命運(yùn)；其有4個受體（Notch1，Notch2，Notch3，Notch4）和5 個配體（JAG1，JAG2，DLL1，DLL3，DLL4，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí)，但不同配體和受體其的作用具有一定異質(zhì)性，比如JAG1與乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)；缺氧誘導(dǎo)的JAG2可以促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞的自我更新；DLL1通過影響細(xì)胞增殖和血管生成來促進(jìn)管腔型乳腺癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，并且DLL1與乳腺癌化療耐藥有關(guān)；DLL4 在乳腺癌細(xì)胞中也過表達(dá)，并與淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。眾所周知，Notch1在乳腺癌中主要作為癌基因發(fā)揮作用，而Notch2 在乳腺癌中的具體作用仍然不明確。Notch 3通過抑制乳腺癌的EMT從而抑制肺轉(zhuǎn)移，但是也有功能研究證明Notch 3可以促進(jìn)基底乳腺癌的生長，表現(xiàn)出促癌作用；Notch 4 可以觸發(fā)與乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)的EMT過程。不同Notch分子發(fā)揮著不同的功能，因此需要系統(tǒng)研究Notch信號在乳腺癌中的作用。

現(xiàn)有的研究顯示，DLL4-Notch1也參與了腫瘤血管生成，但Notch信號通路中的其他配體，比如JAG1等，在腫瘤血管生成中的研究較少，而JAG1與乳腺癌血管生成的關(guān)系尚未還未見報(bào)道。因此，本研究擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確JAG1對TNBC增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)功能的影響，初步研究JAG1對TNBC微環(huán)境血管生成的影響，探討其是否能成為TNBC的診療新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10a、TNBC細(xì)胞MDAMB-231（231）、侵襲性TNBC 細(xì)胞MDA-MB-231-B（231B）以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）保存于重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。JAG1重組蛋白（rJAG1）及DAPT（MedChemExpress）；胎牛血清（BS）、青霉素、鏈霉素（S110JV）和DMEM高糖培養(yǎng)基（上海源培生物）；MCF-10a細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽）；基質(zhì)膠（matrilgel matrix 356234）及Transwell小室（康寧）；RNA快速提取試劑盒（ES-RN001）（上海奕杉生物科技）；RT-PCR及Q-PCR 相關(guān)試劑（TaKaRa）；蛋白質(zhì)提取與定量試劑、Western blot相關(guān)試劑、DAPI、Hoechst染色試劑盒及HE染色試劑盒均（上海碧云天）；ECL 發(fā)光液（Millipore）；鼠抗人β-actin 抗體（鐘鼎生物）；兔抗人JAG1、Twist1、Snail、Cyclin-B1、Cyclin-E、Bcl-2、VEGFA、CD31 抗體（沈陽萬類生物科技）；兔抗人ERK及p-ERK抗體（Abcam）；小鼠SP試劑盒，兔SP試劑盒，二抗（山羊抗鼠IgG/HRP標(biāo)記，山羊抗兔IgG/HRP標(biāo)記）（中杉金橋）；兔抗人FITC熒光二抗（proteintech）；Q-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-10a正常乳腺上皮細(xì)胞用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，231、231B和HUVEC用含1000 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并靜置于37 ℃、50 mL/L CO的培養(yǎng)箱。細(xì)胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 231和231B細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，胰蛋白酶消化1 min，傳代接種于20 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)（1×10），待細(xì)胞長至50%～60%的匯合度。棄去原培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿加入2 mL新鮮培養(yǎng)基。rJAG1以50 ng/mL的量加入231細(xì)胞培養(yǎng)皿，DAPT以50 μmol/L的濃度處理231B細(xì)胞。TNBC實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為4組：（1）231 空白對照組（231-Blank）；（2）rJAG1 處理231 組（231-rJAG1）；（3）231B空白對照組（231B-Blank）；（4）DAPT處理231B組（231B-DAPT）。輕輕晃動混勻后放孵箱培養(yǎng)24～48 h，用于細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。收集上述各組乳腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）用于后續(xù)血管實(shí)驗(yàn)。以CM：新鮮培養(yǎng)基=1∶1的比例處理HUVEC細(xì)胞24～48 h后，進(jìn)行后續(xù)處理。血管生成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為5組：（1）HUVEC細(xì)胞陰性對照組（NC）；（2）231空白條件培養(yǎng)基處理組（231-Blank-CM）；（3）rJAG1處理231的條件培養(yǎng)基處理組（231-rJAG1-CM）；（4）231B空白條件培養(yǎng)基處理組（231B-Blank-CM）；（5）DAPT處理231B的條件培養(yǎng)基處理組（231B-DAPT-CM）。

通過Q-PCR 實(shí)驗(yàn)篩查Notch 信號通路相關(guān)分子（Notch1、Notch2、JAG1、JAG2、DLL1、DLL4）發(fā)現(xiàn)，231細(xì)胞的JAG1 表達(dá)低于MCF-10a 正常乳腺上皮細(xì)胞（＜0.05），同時，231B 細(xì)胞的JAG1 表達(dá)高于231（＜0.05）和MCF-10a（＜0.05）（圖1A），DLL1的表達(dá)情況和JAG1一致。PrognoScan數(shù)據(jù)庫分析JAG1對乳腺癌患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率（DMFS）和無復(fù)發(fā)生存率（RFS）。發(fā)現(xiàn)JAG1高表達(dá)的乳腺癌患者有相對較差的DMFS（圖1B）和RFS（圖1C）。

1.2.4 Western blot 法檢測231、231B乳腺癌細(xì)胞Actin、JAG1、Twist1、Snail、Cyclin-B1、Cyclin-E及Bcl-2蛋白表達(dá) 231乳腺癌株用rJAG1處理24～48 h和231B侵襲性乳腺癌細(xì)胞株用DAPT處理24～48 h后，收集細(xì)胞，使用RIPA裂解后提取總蛋白，并使用BCA法測其濃度。取35 μg蛋白質(zhì)經(jīng)10%的SDS-PAGE分離（90 V 30 min，120 V 60 min），210 mA恒流冰浴條件下將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用50 g/L的牛血清白蛋白于37 ℃搖床上封閉2 h，4 ℃條件下一抗孵育過夜，Actin、JAG1、Twist1、Snail、Cyclin-B1、Cyclin-E及Bcl-2 的抗體使用一抗稀釋液以1∶1000稀釋。TBST洗膜10 min×3次，分別加入HRP標(biāo)記的1∶5000稀釋的山羊抗兔IgG或HRP 標(biāo)記的1∶5000 稀釋的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×3 次，ECL發(fā)光液顯影并統(tǒng)計(jì)。

風(fēng)影還想紅琴，想她為什么要在林子里掛一根紅腰帶，帶子掛到樹枝上了，她還拿什么去系褲子，沒有帶子系褲子，萬一掉下來怎么辦？他的臉忽然紅了。他又去想那紅腰帶上的結(jié)，為什么要打結(jié)，為什么要打七七四十九個，如果打一千個結(jié)的話，繩子短了沒法再打怎么辦？他忽然又笑了，打一千個結(jié)，那要打到猴年馬月？難道要打到自己變成像師父那樣的老和尚么？難道要打到紅琴變成白發(fā)蒼蒼的老太婆么？那就早點(diǎn)瞅個機(jī)會下山去吧，讓她早點(diǎn)打完七七四十九個結(jié)。對了，這次下山千萬別忘了帶上那支竹笛，她喜歡聽就吹給她聽唄。

各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次后，用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)差異采用Tukey檢驗(yàn)。以＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

玉米品比試驗(yàn)采用間比法排列，不設(shè)重復(fù)，每6個品種設(shè)置1個對照品種，4行區(qū)，小區(qū)面積20平方米。同一排首、末小區(qū)必須是對照品種，并設(shè)不少于4行的保護(hù)區(qū)。測產(chǎn)時收取小區(qū)中間2行(面積10平方米)全部果穗，風(fēng)干脫粒后稱籽粒重量，測含水量，折成14%水分計(jì)產(chǎn)。

HE染色裸鼠肝臟組織，接種231B細(xì)胞的裸鼠較231表現(xiàn)出更強(qiáng)的肝臟轉(zhuǎn)移（圖2A），肝臟轉(zhuǎn)移常常伴隨著大量新生血管的形成，為腫瘤細(xì)胞的定植提供營養(yǎng)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示231B腫瘤比231腫瘤表達(dá)更高的VEGFA，且CD31標(biāo)記的血管數(shù)量也更多（紅色箭頭所示）（圖2B）。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)同樣表明231B腫瘤較231腫瘤表達(dá)更高的VEGFA（圖2C）。

1.2.9 基質(zhì)膠血管形成實(shí)驗(yàn)檢測TNBC微環(huán)境對血管生成的影響 96孔板加入基質(zhì)膠50 μL/孔，隨后將96孔板置于37 ℃孵箱45 min。胰蛋白酶消化HUVEC后，使用231和231B的條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入50 μL 3×10細(xì)胞至上述96孔板內(nèi)，放入37 ℃孵箱，4～6 h后倒置顯微鏡下觀察血管形成情況，并對血管節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)量化。

1.2.6 Wound healing實(shí)驗(yàn)檢測JAG1和DAPT對TNBC細(xì)胞遷移的影響 將231和231B細(xì)胞傳至6孔板（3.0×10/孔），待細(xì)胞長滿孔板，使用10 μL 的槍頭垂直于孔板對細(xì)胞劃一條直線，PBS洗去漂浮細(xì)胞。每孔加入2 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，其中231-rJAG1組加入50 ng/mL 的rJAG1，231B-DAPT 組加入50 μmol/L的DAPT。顯微鏡下拍攝0、24和48 h同一位置的劃痕圖片。平均劃痕愈合率的計(jì)算采用以下公式：（0 h劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h劃痕寬度和（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度，其中劃痕寬度利用AI軟件分析得到。

由2.1節(jié)介紹可以看出，不論是哪種傳統(tǒng)的交叉方法都是隨機(jī)選則父代中的交叉位置，這樣容易破壞父代種群的優(yōu)良基因，且易造成局部收斂。本文利用蟻群算法的正反饋機(jī)制，將染色體等分為若干個區(qū)間，并給每個區(qū)間添加信息素。由此可以得到信息素與適應(yīng)度之間的公式為：

1.2.8 內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測JAG1對231細(xì)胞粘附的影響 各組231和231B細(xì)胞使用GFP病毒轉(zhuǎn)染，24 h后細(xì)胞90%以上細(xì)胞被轉(zhuǎn)染上GFP綠色熒光蛋白，添加rJAG1/DAPT 條件處理24 h。胰蛋白酶消化HUVEC細(xì)胞至24 孔板，待HUVEC 長至滿視野后，消化各組乳腺癌細(xì)胞，加入3×10/孔231和231B細(xì)胞至上述24孔板，隨后將24孔板置于37 ℃孵箱1 h。PBS洗去未貼壁細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察貼在HUVEC表面的231和231B乳腺癌細(xì)胞數(shù)量，貼壁細(xì)胞使用Image J 軟件計(jì)數(shù)。

1.2.10 免疫組化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤VEGFA和CD31表達(dá)雌性裸鼠分為231組（5只，乳腺脂肪墊注射231 細(xì)胞1×10/只）和231B 組（5 只，乳腺脂肪墊注射231B細(xì)胞1×10/只）。4～6周后取出腫瘤保存于4%多聚甲醛溶液。對腫瘤組織行石蠟切片后，進(jìn)行免疫組化染色，VEGFA和CD31使用一抗稀釋液以1∶200稀釋，更多步驟參考中杉金橋小鼠SP試劑盒說明書，倒置顯微鏡觀察VEGFA和CD31表達(dá)并拍照。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，對組織行冰凍切片，4%多聚甲醛固定15 min，50g/L山羊血清室溫封閉1 h，PBS洗3 min×2次，1∶200稀釋的VEGFA一抗4 ℃冰箱孵育過夜。熒光二抗室溫孵育1 h，PBS洗3 min×2次，DAPI染色10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度并拍照。HE 染色檢測TNBC肝臟轉(zhuǎn)移灶，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考碧云天HE染色試劑盒說明書，普通光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。所有涉及動物的實(shí)驗(yàn)操作均按照《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會（2021-023）批準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.2.5 CCK-8法檢測JAG1和DAPT對TNBC細(xì)胞增殖的影響 將231 和231B 細(xì)胞傳入96 孔板培養(yǎng)（3000/孔），其中231-rJAG1組加入50 ng/mL的rJAG1，231BDAPT 組加入50 μmol/L 的DAPT，每組設(shè)置5 個孔，37 ℃孵箱培養(yǎng)0、24、48、72 h后，每孔加入10 μLCCK-8試劑，37 ℃孵育1h 后酶標(biāo)儀測其的光密度（）。Hoechst染色實(shí)驗(yàn)檢測JAG1和DAPT對TNBC細(xì)胞凋亡的影響。24孔板每孔3×10個231和231B細(xì)胞，接受處理24 h后，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3 min×2次。加入500 μL/孔Hoechst 33258染色液，染色5 min，PBS洗3 min×2次。熒光顯微鏡檢測呈藍(lán)色的細(xì)胞核。

2 結(jié)果

2.1 JAG1與TNBC的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測MCF-10a正常乳腺上皮細(xì)胞和231、231B乳腺癌細(xì)胞中JAG1的表達(dá) 細(xì)胞中總RNA用RNA快提試劑盒提取，并用紫外分光光度計(jì)測其濃度和純度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，利用實(shí)時熒光定量PCR 檢測并分析Notch1、Notch2、JAG1、JAG2、DLL1、DLL4、VEGFA和GAPDH的相對表達(dá)水平，其中GAPDH作為內(nèi)參對照。引物序列見表1。

2.2 動物實(shí)驗(yàn)證明高表達(dá)JAG1的231侵襲細(xì)胞株表達(dá)更高的VEGFA和CD31

1.2.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測JAG1和DAPT對TNBC細(xì)胞侵襲的影響 為了檢測231和231B乳腺癌細(xì)胞的侵襲性，將Transwell小室放入24孔板，上室加入1∶10無血清培養(yǎng)基稀釋的基質(zhì)膠50 μL，隨后將24孔板置于37 ℃孵箱1 h。胰蛋白酶消化細(xì)胞后用雙無培養(yǎng)基重懸，上室加入200 μL 含3×10細(xì)胞的懸液，下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)基，37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h后，取出上室，4%多聚甲醛固定15 min，0.05%結(jié)晶紫染色或DAPI染色10 min，棉簽輕輕擦拭掉小室上方細(xì)胞，干燥后在倒置顯微鏡（結(jié)晶紫染色）和熒光顯微鏡（DAPI染色）下觀察侵襲到小室下方的細(xì)胞數(shù)量。

司馬遷生年迄無確認(rèn)，最有代表性的有兩說，即以李長之先生《司馬遷生年為建元六年辨》及郭沫若先生《〈太史公行年考〉有問題》為代表的生于漢武帝建元六年(前135)說，和以王國維先生《太史公行年考》及錢穆先生《司馬遷生年考》為代表的生于漢景帝中五年(前145)說，兩說各執(zhí)其辭，爭論將近一個世紀(jì)。本文擬對此問題作一分析。

2.3 JAG1通過抑制凋亡影響TNBC的數(shù)量

WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JAG1重組蛋白可以促進(jìn)231的JAG1蛋白水平（＜0.01），而DAPT可以抑制231B的JAG1蛋白表達(dá)（＜0.001，圖3A）。Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DAPT可以抑制JAG1的基因表達(dá)水平（＜0.01，圖3B）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JAG1對231乳腺癌細(xì)胞的增殖沒有顯著影響（＞0.05），而DAPT處理231B細(xì)胞72 h后，其活力明顯受到了抑制（＜0.05，圖3C）。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測231和231B增殖相關(guān)蛋白顯示，JAG1不影響231的Cyclin-B1和Cyclin-E表達(dá)，而DAPT可以顯著抑制231B 的Cyclin-B1（＜0.0001）和Cyclin-E（＜0.05）的蛋白表達(dá)（圖3D）。Hoechst染色結(jié)果顯示（圖3E），231細(xì)胞經(jīng)過rJAG1處理后，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)了明顯的減弱，231空白對照組細(xì)胞凋亡數(shù)為8.0±0.9個/視野，rJAG1 處理組細(xì)胞凋亡數(shù)為4.5±0.6 個/視野，rJAG1處理組較空白組凋亡數(shù)顯著降低（＜0.05）。同樣，DAPT-231B組的細(xì)胞凋亡數(shù)為10.5±1.0個/視野，231B 空白對照組的細(xì)胞凋亡數(shù)為4.0±0.9 個/視野，DAPT 處理組較空白組凋亡數(shù)顯著升高（＜0.01）。Western blot結(jié)果同樣顯示，233細(xì)胞經(jīng)過rJAG1處理后，可上調(diào)231細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的水平（＜0.05），相反，DAPT 處理231B 細(xì)胞則會下調(diào)其抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（＜0.05，圖3F）。

隨著社會的發(fā)展，我國的環(huán)保意識不斷增強(qiáng)，很多地區(qū)的林業(yè)建設(shè)慢慢成為重要的生產(chǎn)活動，筆者結(jié)合從業(yè)經(jīng)驗(yàn)，圍繞生態(tài)林業(yè)建設(shè)中林業(yè)技術(shù)推廣存在的問題，闡述了新時期林業(yè)技術(shù)推廣的有效方式，以期為業(yè)內(nèi)人士提供參考。

2.4 JAG1促進(jìn)TNBC的遷移、侵襲及黏附能力

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4A），在rJAG1處理48 h后，231乳腺癌細(xì)胞的遷移受到了明顯的促進(jìn)（＜0.05），愈合率為85.95%，而與231空白對照組相比，48 h后231空白對照組的愈合率僅為58.52%。DAPT處理231B乳腺癌細(xì)胞后，231B細(xì)胞的遷移能力受到了明顯的抑制（＜0.05），48 h愈合率為36.62%。未加DAPT的231B空白對照組的遷移率為53.31%。使用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測rJAG1和DAPT對TNBC細(xì)胞侵襲性的影響，在處理24 h后，rJAG1處理組231乳腺癌細(xì)胞穿透小室的數(shù)量為629個，而231空白對照組穿過了270個細(xì)胞；同樣使用DAPT 處理231B 細(xì)胞后，其穿過的細(xì)胞數(shù)（154 個）遠(yuǎn)低于231B 對照組穿過的細(xì)胞數(shù)（397 個）（圖4B）。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測231和231B遷移侵襲相關(guān)蛋白顯示，JAG1促進(jìn)了231的Twist1和Snail的蛋白表達(dá)，而DAPT可以顯著抑制231B的Twist1和Snail的蛋白表達(dá)（圖4C）。內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明，DAPT顯著（＜0.01）抑制了231B細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性，而rJAG1顯著增加了231乳腺癌細(xì)胞的粘附性。

2.5 TNBC的JAG1過表達(dá)促進(jìn)血管生成

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析JAG1與血管生成因子VEGFA的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者成正相關(guān)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=8.9e-16，圖5A）。在乳腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理24～48 h 后，231B-DAPT-CM 組的HUVEC 的VEGFA表達(dá)較231B-Blank-CM 組明顯受到了抑制（＜0.0001），而231-rJAG1-CM組的HUVEC的VEGFA表達(dá)較231-Blank-CM 組的VEGFA 表達(dá)明顯升高（＜0.05，圖5B）。CCK-8的實(shí)驗(yàn)證明，乳腺癌的JAG1過表達(dá)可促進(jìn)HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，DAPT可以抑制這一現(xiàn)象（圖5C）。231B條件培養(yǎng)基的促血管生成能力明顯強(qiáng)于231的條件培養(yǎng)基（＜0.05），并且可以被DAPT抑制（圖5D）。

3 討論

研究顯示，乳腺癌已取代肺癌成為全球腫瘤發(fā)病率最高的腫瘤，占新發(fā)腫瘤的11.7%。雖然針對乳腺癌治療的方法有了長足的進(jìn)步，包括手術(shù)治療、放療、化療和以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療，但乳腺癌導(dǎo)致的死亡仍占女性癌癥患者死亡原因的1/6，尤其是TNBC。由于TNBC的雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2（HER2）為陰性，因此患者不能從內(nèi)分泌或分子靶向治療中獲益；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)TNBC血管密度高，患者或許能從抗血管治療中獲益，研究顯示現(xiàn)有的抗血管生成藥物（靶向VEGFVEGFR）的療效并未達(dá)到預(yù)期，提示關(guān)于TNBC的腫瘤血管生成機(jī)制研究至關(guān)重要。

綜上所述，MRAA-LDA-DAO產(chǎn)前超聲具有較典型的超聲特征，但是僅根據(jù)其3VT切面上的表現(xiàn)，不易與右弓優(yōu)勢型DAA鑒別，而這兩種疾病預(yù)后完全不同，DAA胎兒因形成完全血管環(huán)，左、右弓壓迫食管，出生后多會出現(xiàn)相關(guān)的臨床癥狀而需手術(shù)治療，而MRAA-LDA-DAO胎兒多無臨床癥狀，不需特殊處理。所以建議在掃查中增加掃升弓部冠狀切面，明確主動脈“第一分支”與LDA的關(guān)系，明確診斷MRAA-LDA-DAO或者右弓優(yōu)勢型DAA，為圍產(chǎn)期咨詢和產(chǎn)后及時救治提供更全面可靠的信息。

本研究首先通過實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)侵襲性強(qiáng)的TNBC細(xì)胞株231B中JAG1表達(dá)明顯增加；JAG1是乳腺癌的預(yù)后不良因子之一，與DMFS和RFS顯著相關(guān)，這一結(jié)果與Xue和劉野的臨床研究結(jié)論一致。進(jìn)一步裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JAG1高表達(dá)的231B腫瘤表現(xiàn)出更強(qiáng)的肝臟轉(zhuǎn)移能力，腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子VEGFA和血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31表達(dá)增強(qiáng)。通過生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)JAG1能明顯增強(qiáng)231的遷移、侵襲能力，還可通過抑制凋亡促進(jìn)腫瘤生長，這與Yihong chen等在宮頸癌中的研究一致。內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明，DAPT顯著（＜0.01）抑制了231B細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性，而rJAG1顯著增加了231乳腺癌細(xì)胞的粘附性，同樣，可以發(fā)現(xiàn)侵襲性更強(qiáng)的231B乳腺癌細(xì)胞株比普通231細(xì)胞株具有更強(qiáng)的黏附性。DAPT可以抑制Notch1、JAG1信號通路的分子表達(dá)，本研究中DAPT抑制了231B的生物學(xué)功能，由于Notch1在231B中表達(dá)低于正常乳腺上皮細(xì)胞（＜0.05），并且231和231B的Notch1表達(dá)沒有差異，因此JAG1發(fā)揮了促進(jìn)TNBC侵襲性的功能。

那么JAG1 對TNBC 腫瘤血管生成有什么影響呢？我們通過基因共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)JAG1與血管內(nèi)皮生長因子VEGFA成正相關(guān)，提示JAG1與VEGFA可能協(xié)同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成。我們利用高表達(dá)JAG1的231B條件培養(yǎng)基處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，Q-PCR實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，而基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)表明JAG1高表達(dá)的TNBC能明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力，這些結(jié)果與Tsung-hoying等關(guān)于VEGFA對血管生成的影響相一致，支持我們關(guān)于JAG1與VEGFA功能相似，協(xié)同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力的猜想。

綜上所述，本研究通過一系列體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了JAG1 對TNBC 惡性表型的影響，初步證實(shí)JAG1能促進(jìn)乳腺癌血管生成，可能與VEGFA協(xié)同促進(jìn)血管生成。這一研究結(jié)果提示JAG1可以作為TNBC抗血管治療的潛在靶點(diǎn)，但JAG1 是否與DLL4 等其他Notch配體相互配合調(diào)控腫瘤血管生成，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。