下調SIK2可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷：基于mTOR-ULK11信號通路的下調與細胞自噬的減少

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）是世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因之一，其發(fā)病率及病死率逐年升高，嚴重威脅人類健康；其最常見的形式是心肌梗死（MI）。CHD最有效的治療措施是盡早盡快恢復缺血區(qū)域血流，減少急性心肌缺血性損傷和梗死范圍。但缺血一段時間后的血流恢復會導致繼發(fā)的心肌缺血再灌注損傷，許多復雜的過程參與缺血再灌注損傷，包括離子積累、線粒體膜電位破壞、活性氧（ROS）的形成、一氧化氮代謝失調、血小板聚集、免疫激活、凋亡和自噬。

自噬在缺血再灌注損傷中被顯著激活，同時也是心肌缺血再灌注損傷的主要調節(jié)過程。有研究發(fā)現，mTOR是自噬的重要調控分子，在不同條件下可以通過PI3K/AKT/mTOR、AMPK/mTOR/ULK1信號通路調控自噬。研究報道自噬過程對心臟發(fā)育，結構和功能的基本形成具有重要意義，廣泛參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如心力衰竭、心肌病、缺血性心臟病和缺血再灌注損傷等。研究表明，多種藥物均可通過mTOR調控心肌細胞自噬水平，從而改善心肌I/R損傷，但具體作用機制尚不明確。

由懸掛系統(tǒng)與下層橋架的裝配關系(見圖4),為使橋架移動時因軌道不平導致耳板銷軸與軸殼孔不同心度較大時仍能正常工作,耳板通過關節(jié)軸承與銷軸連接,因軸承主要承受徑向載荷,故選用向心關節(jié)軸承.

6)第一次空中三角測量預測了導入的控制點在影像上的大概位置，由此減輕了人工尋找控制點點位的負擔。這種方法還可以用來發(fā)現和排查野外像控點錯誤。

鹽誘導激酶2（SIK2）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶屬于AMPK家族成員，本課題組已有關于SIK2在腦缺血再灌注過程中對大鼠能量代謝的影響研究。有研究表明，SIK2在細胞自噬體成熟和自噬過程中發(fā)揮重要作用，但是SIK2是否通過自噬影響心肌缺血再灌注以及作用機制目前尚未明確。本研究旨在探究SIK2通過mTOR/ULK1信號通路調控細胞自噬對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響,從而為臨床心肌缺血再灌注損傷的治療提供一個新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

4～6周齡的SD雄性大鼠（體質量200～220 g），由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0014。本研究所有動物均經皖南醫(yī)學院動物保護與倫理委員會批準（LLSC-2022-005）。大鼠隨機分為3組（5只/組），假手術對照組：只用絲線穿過左冠脈不結扎；缺血再灌注組：缺血30 min，灌注2 h；SIK2抑制組：術前24 h，使用博舒替尼對大鼠進行左股靜脈給藥，給藥劑量為10 mg/kg；24 h 后進行缺血30 min，再灌注2 h。

將大鼠心臟組織在4%多聚甲醛中浸泡24 h后進行脫水、包埋、切片和染色。取完整心臟組織從心尖部開始分割成3等份，保證每片心臟組織的厚度為2～3 mm（均為橫斷面），放入全自動脫水機；利用梯度乙醇和HE染液分別將心肌細胞的細胞質和細胞核染成紅色和藍色，中性樹膠封片后，光學顯微鏡下觀察細胞結構及形態(tài)的改變。

1.2 主要材料

SIK2抑制劑博舒替尼（Bosutinib）為碧云天公司產品；兔多克隆抗體抗SIK2和兔多克隆抗體GAPDH（貨號bs-6930R、bs-0755R，北京博奧森技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（貨號A0208，碧云天生物技術有限公司）；兔多克隆抗體LC3B（貨號A7198，ABclonal）；兔多克隆抗體Beclin 1、p-ULK1（Ser757）、ULK1、mTOR、p-mTOR（貨號3495、14202、8054、2983、5536，CST）；兔多克隆抗 體p62（貨 號AF5384，affinity）。小動物呼吸機（HX-101E）、小動物心電圖機（BL-420S）（成都泰盟軟件有限公司）；超聲儀器（EPIQ7C，探頭L12-，飛利浦）。

本發(fā)明公開了一種利用鉬尾礦代替黏土制備普通硅酸鹽水泥熟料的方法，它涉及建筑材料制備技術領域。將原料石灰石、鉬尾礦和調整劑以質量百分比分別為70%～85%、5%～20%、0%～10%進行混合,待攪拌均勻后，將混合料進行粉磨制成生料,將生料輸送至干法回轉窯系統(tǒng)中煅燒，煅燒結束后冷卻后形成普通硅酸鹽水泥熟料。利用鉬尾礦工業(yè)固體廢棄物生產普通硅酸鹽水泥熟料，其不僅可以代替黏土，保護耕地，消耗了對社會環(huán)境有害的工業(yè)廢棄物，為工業(yè)廢料的綠色處理提供了一種途徑。鉬尾礦是選鉬、選鐵后剩下的固體物理，選鉬選鐵過程中已經進行磨礦，因此磨粉成本有所降低。

1.3 建立心肌缺血再灌大鼠模型

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。正態(tài)分布的計量數據以均數±標準差表示，兩組之間比較采用獨立樣本檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 構建SIK2減少組心肌缺血再灌注模型

造模前24 h，經腹腔麻醉后將大鼠固定在鼠板上。左側股靜脈處剪開，分離出左股靜脈，隨后注射器緩慢注射博舒替尼10 mg/kg（2～3 min），注射完畢后按壓5 min，縫合，消毒繃帶包扎，24 h后開始建立心肌缺血再灌注模型。

1.5 超聲檢測心功能

取之前存于-80 ℃冰箱的心肌組織，切取左心室組織，剪碎，加入裂解液，研磨后冰上靜置30 min，離心后取上清液即為總蛋白含量，進行分裝。分裝后的樣本與5×上樣緩沖液混勻后95 ℃變性7～10 min，進行上樣、凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗（SIK2、LC3B、Beclin 1、p62、p-ULK1（Ser757）、ULK1、mTOR、p-mTOR，稀釋比例均為1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，稀釋倍數為1∶10 000，孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學發(fā)光底物，化學發(fā)光檢測儀檢測蛋白表達。以GAPDH為內參，采用Image J軟件對圖像中條帶的灰度值進行相對定量分析。

1.6 HE染色觀察心臟病理學改變

相對凝血功能障礙和嚴重酸中毒，體溫的盡早恢復顯得更為重要。因為正常的體溫是維持有效的凝血及代謝酶聯(lián)反應的關鍵，只有中心體溫超過35 ℃才可能出現正常的凝血功能[10]。研究表明，中度低體溫(32～34 ℃)每減少1 ℃能夠直接影響血小板凝血功能及減少10%凝血因子活性[16-17]。本研究結果顯示，研究組患者的術后體溫恢復時間、休克糾正時間、乳酸清除時間、PT恢復時間和住院時間均少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示，術前ISS相近的嚴重腹部創(chuàng)傷患者接受DCS手術有利于術后患者病情恢復，DCS理念對高原嚴重腹部創(chuàng)傷的救治具有重要意義[11]。

1.7 蛋白質印跡檢測

將大鼠麻醉，使用超聲多普勒血流儀檢測左心室功能，至少檢測3個連續(xù)、完整的心動周期，指標為大鼠左心射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、舒張末期室間隔厚度（IVSDd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWDd）。

1.8 統(tǒng)計學方法

大鼠禁食10 h后，腹腔注射25%烏拉坦（4～5 mL/kg）麻醉，待大鼠完全麻醉后將大鼠固定于恒溫鼠板上，記錄正常心電圖，消毒并備皮，剪開頸部正中皮膚，暴露頸部氣管，進行氣管插管，連接小型動物呼吸機進行機械通氣。自左側3～4肋間開胸，輕壓右側胸廓暴露心臟，迅速穿線結扎冠狀動脈左前降支(假手術組大鼠只穿線不結扎)，將心臟送回胸腔內，快速擠出胸腔內空氣隨后立即關閉胸腔。觀察心電圖變化，以ST段抬高或下降0.2 mV為造模成功標志，缺血30 min后開胸，松解結扎線使血流再灌，縫合胸部皮膚，再灌注2 h 后取心臟，-80 ℃凍存或4%多聚甲醛浸泡。

2 結果

2.1 模型的構建及評價

缺血再灌注組與正常組大鼠相比，大鼠心電圖ST段顯著抬高，T波與QRS波逐漸融合，表示心梗模型成功（圖1）。

近年來，各醫(yī)學院校相繼開展機能實驗學整合。機能實驗學課程的開展，是醫(yī)學院校實驗教學改革的必然要求。該課程除了教師和學生兩大主體的參與，也離不開實驗技術人員。隨著學科建設不斷深入，機能實驗課程內容變得更加充實和復雜，對參與者提出了更高要求。實驗技術人員的工作水平從一定程度上反映了機能實驗中心的教學水平、科研水平和管理水平。但是，目前實驗技術人員的工作素養(yǎng)與實際工作缺乏有機結合，工作現狀亟待改善。

2.2 SIK2與大鼠心肌缺血再灌注的相關性

如今已是西藏大學理學院教授、鐘揚的學生拉瓊發(fā)現，病后稍有恢復的鐘老師開始變本加厲地工作，一天排滿了各種事。他的衣袋里總是裝著很多小紙片，上面密密麻麻寫滿各種待辦事項，每做完一項就用筆劃掉。

與假手術組比較，缺血再灌注組SIK2蛋白表達增多（＜0.01，圖2A）?？梢源_定心臟組織缺血再灌注后SIK2表達增多。

對正常大鼠博舒替尼左股靜脈注射，劑量分別為5 mg/kg、10 mg/kg，24 h后直接取其心臟，結果發(fā)現10 mg/kg劑量時大鼠心臟組織SIK含量被明顯抑制（＜0.01，圖2B）。根據結果決定使用10 mg/kg的劑量來作為實驗劑量。

2.3 各組大鼠心臟組織病理學改變

與假手術組相比，缺血再灌注組大鼠LVEF、FS值顯著降低（＜0.001），與缺血再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠LVEF、FS升高（＜0.01），LVPWDd、IVSDd值3組無明顯差別（＞0.05，表1、圖4）。

2.4 超聲觀察各組大鼠心功能的改變

假手術組心肌纖維成分無腫脹紊亂，心肌間質無炎癥細胞浸潤。缺血再灌注組，心肌細胞水腫，部分心肌細胞出現核溶解、核碎裂，心肌纖維中間出現空洞，壞死心肌細胞周圍可見大量急性炎癥細胞浸潤。SIK2抑制劑組顯示心肌組織細胞病理變化減輕（圖3）。

2.5 各組大鼠中自噬蛋白的表達情況

與假手術組比較，缺血再灌注組大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達增多（＜0.01），p62 蛋白表達降低（＜0.001）；與缺血在再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達降低（＜0.05），p62蛋白表達增高（＜0.01，圖5）。

2.6 SIK2通過mTOR/ULK1信號通路調控自噬

與假手術組相比，缺血再灌組大鼠p-mTOR蛋白表達顯著降低（＜0.0001），p-ULK1（Ser757）蛋白表達增高（＜0.01）；與缺血再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠p-mTOR蛋白表達增高（＜0.01），p-ULK1（Ser757）蛋白表達降低（＜0.05）；3組mTOR、ULK1蛋白表達無明顯差別（＞0.05，圖6）。

2.7 TEM觀察各組大鼠心肌細胞自噬情況

假手術組心肌纖維排列整齊，心肌細胞結構完整，細胞核及線粒體形態(tài)和數量正常；與假手術組相比，缺血再灌注組可見心肌肌纖維溶解、斷裂甚至壞死，有明顯腫脹，線粒體嵴突紊亂及空泡化嚴重，而且可見自噬小泡，有較多自噬體形成。與缺血在再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠心肌細胞腫脹、空泡化減輕，壞死灶減輕，而且自噬體形成較少（圖7）。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明自噬廣泛參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，因此調控自噬成為減輕心肌缺血再灌注損傷的一個潛在治療靶點。自噬是心肌缺血再灌注損傷的重要分子機制，參與自噬的信號轉導分子和通路的調控非常復雜。AMPK-mTORUlk1 通路是調節(jié)自噬的重要信號通路，AMPK在缺血再灌注過程中被激活。AMPK激活可導致mTOR失活和ULK1（Ser757）激活，從而促進自噬。SIK2是AMPK亞家族成員之一，已有研究表明SIK2在缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，然而其影響缺血性疾病進展的具體機制仍然是未知的。所以本研究探究在心肌缺血再灌注損傷過程中，SIK2是否通過調控細胞自噬，影響心肌組織的損傷。

本研究通過注射博舒替尼調控SIK2表達水平，建立大鼠心梗模型，繼而觀察下游靶基因的表達水平變化趨勢以及心臟損傷的情況，檢測自噬相關蛋白來判斷SIK2與自噬之間的機制。實驗結果表明，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌細胞發(fā)生損傷，LVEF、FS 值下降，LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白表達增多，p62蛋白表達減少，心肌組織SIK2蛋白表達水平增加；上述結果說明缺血再灌注可以誘發(fā)心肌細胞發(fā)生過度自噬，從而加重大鼠心肌缺血再灌注損傷，表現為病理損傷加重，心臟射血分數降低。為了探究大鼠心肌缺血再灌注過程中自噬水平增加是否和SIK2有關，使用SIK2的抑制劑來驗證，發(fā)現與模型組相比SIK2抑制劑組心肌細胞損傷減輕，LVEF、FS值升高，LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白表達減少，p62蛋白表達增多，結果說明心肌缺血再灌注損傷過程中SIK2的表達上調可以促進自噬，使用SIK2抑制劑可抑制心肌異常自噬減輕心肌缺血再灌注損傷。此前大量研究表明，心肌缺血再灌注會導致細胞內產生大量ROS，從而引發(fā)自噬，然而自噬引起的結局有所區(qū)別，有的研究認為促進自噬可加重損傷［，有的研究認為促進自噬可以減輕損傷。雖然許多研究中存在一些相悖的結果，但是大家的共同認識是，自噬的短期和中度激活可能會通過降解功能失調或受損的蛋白質和細胞器來促進細胞存活，從而產生有益的影響，而自噬的持續(xù)升高可能會促進細胞死亡。為了進一步探究SIK2是通過何種機制調控自噬水平，研究中檢測了mTOR-Ulk1相關通路蛋白，結果表明，大鼠心肌缺血再灌注后心肌組織SIK2、p-ULK1（Ser757）蛋白表達增多，p-mTOR蛋白表達減少；而在SIK2抑制劑組SIK2、p-ULK1（Ser757）蛋白表達減少，p-mTOR蛋白表達增多。這些結果提示我們在心肌缺血再灌注損傷過程中，SIK2通過調控mTOR-ULK1來影響自噬水平。

綜上所述，在大鼠心肌再灌注損傷發(fā)生過程中，抑制SIK2可以下調mTOR-Ulk1 信號通路，抑制細胞過度自噬，改善大鼠心功能，減少心肌細胞損傷，對心肌缺血再灌損傷起到良好的保護作用。