黃芩素上調miR-625-5p表達干預支氣管哮喘小鼠的機制研究

高 輝，劉 恭，韓仙菊

(石家莊市婦幼保健院藥劑科，河北 石家莊 050011)

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病，通常出現廣泛而多變的可逆性呼氣氣流受限，導致反復發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和咳嗽等癥狀[1]。支氣管哮喘多在夜間或清晨發(fā)作，若診治不及時，隨病程的延長可產生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑[2-3]。常規(guī)的西藥治療很難從根本上解決問題，并且容易反復，會增加繼續(xù)治療的難度，中醫(yī)治療標本兼顧，辨證論治，安全性和療效均較好。中醫(yī)治療哮喘遵“急則治其標”“緩則治其本”原則，慢性期以益氣化痰、降氣平喘為主。黃芩素是黃芩中含量較高的黃酮類化合物之一，黃芩素能夠緩解氣管過敏性收縮及整體過敏性氣喘，具有較廣的抗菌譜，對多種細菌均有抑制作用[4-5]。有研究發(fā)現，miR-625-5p可以調控肺部疾病的進程，miR-625-5p通過靶向調控PRKACA促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲[6]。LncRNA MIR503HG通過miR-625-5p參與肺癌細胞的增殖與凋亡[7]。本實驗主要探討黃芩素調控miR-625-5p表達對支氣管哮喘小鼠ASMCs細胞增殖、遷移及炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞：ASMCs細胞購自中國細胞資源庫。

1.1.2 實驗試劑：重組小鼠血小板衍生生長因子(PDGF)購自蘇州派普泰克生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gbico公司；Lipofectamine 2000購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自北京優(yōu)尼康生物科技公司；Transwell小室購于北京賽因百奧生物技術有限公司；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自大連寶生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗藥物：黃芩素(批號DH0024)購自成都德思特生物技術有限公司，純度>98%。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和分組[8]：ASMCs細胞復蘇后，接種到含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5%CO2。將ASMCs細胞分為對照組、PDGF組和黃芩素低、中、高劑量組。對照組未予干預措施；PDGF組使用PDGF誘導ASMCs增殖；黃芩素低、中、高劑量組分別采用10、20、40 μmol/L黃芩素處理。將miR-NC、miR-625-5p轉染至PDGF誘導ASMCs細胞，作為PDGF+miR-NC、PDGF+miR-625-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-625-5p轉染至PDGF誘導ASMCs細胞，以40 μmol/L的黃芩素處理，作為PDGF+anti-miR-NC+40 μmol/L組、PDGF+anti-miR-625-5p+40 μmol/L組。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖[9]：取各組細胞接種于96孔板，1×103個/孔，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8溶液，10 μl/孔，繼續(xù)孵育2 h，應用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值。根據OD值計算細胞增殖率。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移[9]：取各組細胞，加入DMEM培養(yǎng)液制備單細胞懸液(5×104個/ml)，Transwell小室的上室中每孔加入200 μl細胞懸液，Transwell小室的下室每孔加入600 μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，PBS洗滌后采用多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，置于顯微鏡下觀察遷移細胞數。細胞遷移率=(0 h遷移細胞數量-48 h遷移細胞數量)/0 h遷移細胞數量×100%。

1.2.5 ELISA檢測細胞IL-4、IL-6、IL-8水平[10]：提取細胞上清液，采用ELISA法檢測細胞IL-4、IL-6、IL-8水平，實驗步驟根據試劑盒說明書進行。

1.2.6 RT-qPCR檢測細胞miR-625-5p表達水平[8]：采用TRIzol法提取細胞總RNA，RNA樣品的純度通過紫外分光光度計測量。將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為目的基因進行RT-qPCR。以U6為內參，通過2-△△Ct公式計算miR-625-5p相對表達水平。引物序列如下：miR-625-5p上游引物：5’-CGCGAGGGGGAAAGTTCTA-3’，下游引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

2 結 果

2.1 黃芩素對ASMCs細胞增殖、遷移的影響 與對照組比較，PDGF組細胞增殖率和細胞遷移率顯著升高(P<0.05)；與PDGF組比較，黃芩素低、中、高劑量組細胞增殖率和細胞遷移率顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩素對ASMCs細胞增殖、遷移的影響(%)

2.2 黃芩素對ASMCs細胞IL-4、IL-6、IL-8水平的影響 與對照組比較，PDGF組IL-4、IL-6、IL-8水平顯著升高(P<0.05)；與PDGF組比較，黃芩素低、中、高劑量組IL-4、IL-6、IL-8水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3 黃芩素對ASMCs細胞miR-625-5p表達的影響 與對照組比較，PDGF組細胞miR-625-5p表達水平顯著降低(P<0.05)；與PDGF組比較，黃芩素低、中、高劑量組細胞miR-625-5p表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 黃芩素對ASMCs細胞miR-625-5p表達的影響

2.4 過表達miR-625-5p對ASMCs細胞增殖、遷移及炎性因子的影響 與PDGF+miR-NC組比較，PDGF+miR-625-5p組細胞增殖率和細胞遷移率、IL-4、IL-6、IL-8水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 過表達miR-625-5p對ASMCs細胞增殖、遷移及炎性因子的影響

2.5 抑制miR-625-5p逆轉黃芩素對ASMCs細胞增殖、遷移、侵襲及炎性因子的影響 與PDGF+anti-miR-NC+40 μmol/L組比較，PDGF+anti-miR-625-5p+40 μmol/L組細胞miR-625-5p表達水平顯著降低，細胞增殖率和細胞遷移率、IL-4、IL-6、IL-8顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-625-5p逆轉黃芩素對ASMCs細胞增殖、遷移、侵襲及炎性因子的影響

3 討 論

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥，以反復發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或者咳嗽為主要臨床癥狀[1]。遺傳和環(huán)境是導致哮喘發(fā)作的主要因素，哮喘難以根治，所以應該及時預防和治療[11-12]。

黃芩是唇形科黃芩屬多年生草本植物，臨床抗菌性比較好[13-15]，而且不易產生抗藥性。黃芩素是黃芩中含量較高的化合物，用于治療肺部疾病具有較好的療效[16-17]。本實驗研究發(fā)現，與對照組比較，PDGF組細胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平顯著升高；與PDGF組比較，黃芩素顯著降低增殖率、遷移率以及炎性因子水平。有研究證實，黃芩素通過抑制JAK/STAT通路降低哮喘小鼠氣道平滑肌細胞增殖和遷移[18]。漢黃芩素通過促進中性粒細胞凋亡改善重癥哮喘患者癥狀，緩解病情[19]。黃芪湯加減可以通過降低患者炎癥反應水平，改善慢性阻塞性肺疾病急性加重期動脈血氣和肺功能[20-21]。以上研究結果均與本實驗結果一致。

本實驗研究顯示，與PDGF組比較，黃芩素顯著上調細胞miR-625-5p表達；與PDGF+miR-NC組比較，PDGF+miR-625-5p組細胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平顯著降低。miR-625-5p在卵清蛋白誘導的支氣管哮喘小鼠中表達顯著下調，抑制miR-625-5p有助于減輕哮喘癥狀[22]。miR-625-5p靶向Akt2負調控脂多糖誘導的支氣管上皮細胞的炎癥反應[23]。本實驗研究結果，與PDGF+anti-miR-NC+40 μmol/L組比較，PDGF+anti-miR-625-5p+40 μmol/L組細胞miR-625-5p表達水平顯著降低，細胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平顯著升高。說明抑制miR-625-5p可逆轉黃芩素對支氣管哮喘小鼠ASMCs細胞增殖、遷移及炎性因子的作用。既往多項研究結果與本實驗結果相符。研究表明，黃芩素通過miR-424-3p/PTEN/PI3K/AKT通路抑制非小細胞肺癌增殖，增強順鉑敏感性[24]。黃芩素通過調控miRNA-135b-3p靶向SIX4抑制A549細胞上皮間質轉化[25]。

綜上所述，黃芩素通過上調miR-625-5p表達抑制支氣管哮喘小鼠的細胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平。