復(fù)方腎怡治療狼瘡腎炎小鼠的療效及對(duì)補(bǔ)體旁路途徑激活的研究

陳鏗，鄧翼遙，尚順來(lái)，李清剛，陳香美*

狼瘡腎炎（LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）嚴(yán)重且常見的并發(fā)癥之一［1］。研究表明，LN的發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體的激活相關(guān)［2-3］。多項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)研究顯示，7%～31%的SLE患者在SLE初次診斷時(shí)即被診斷為L(zhǎng)N，31%～48%的SLE患者在隨訪期間被診斷為L(zhǎng)N，4%～28%的LN患者最終進(jìn)展為終末期腎病（ESRD）［4］。臨床上SLE與LN的治療主要以免疫抑制劑與激素為主，但無(wú)論是單純激素治療還是免疫抑制劑治療抑或聯(lián)合治療方案，均僅對(duì)部分患者有效，且激素治療和免疫抑制劑治療常伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，如感染、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥等［5-7］。中藥復(fù)方腎怡（SY）是中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科的自擬方劑，原方為蓮慈湯［8］，由白術(shù)、敗醬草、半邊蓮、補(bǔ)骨脂、黃連、女貞子、三棱、王不留行等藥物組成，藥物主要?dú)w腎、肝、脾經(jīng)，處方功效為活血化瘀、補(bǔ)腎滋陰、清熱解毒、利水消腫。前期研究顯示復(fù)方SY可以通過(guò)影響MRL/lpr小鼠體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞分化，糾正腎臟組織中的輔助性T（Th）1/Th2細(xì)胞的比例失衡，從而改善動(dòng)物的腎臟損害［9-10］。中醫(yī)藥對(duì)疾病的治療常以多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮作用，本研究將探討復(fù)方SY對(duì)LN小鼠的治療作用及對(duì)小鼠補(bǔ)體旁路途徑激活的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批的試驗(yàn)方案（倫審第S2019-095-01號(hào)）進(jìn)行。研究時(shí)間為2021年4—7月。SPF級(jí)MRL/lpr小鼠（8周齡）購(gòu)于卡文斯百格（蘇州）（CAVENS BIOGLE）模式動(dòng)物研究有限公司，共35只，初始體質(zhì)量為（26.6±1.3）g；SPF級(jí)C57BL/6J小鼠（8周齡）購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，共6只，初始體質(zhì)量為（18.4±0.6）g。將上述MRL/lpr小鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為MRL/lpr組（n=8）及SY低劑量組（n=9）、SY中劑量組（n=9）、SY高劑量組（n=9），C57BL/6J小鼠為正常對(duì)照組（n=6）。上述動(dòng)物均飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF環(huán)境下光暗循環(huán)12 h，溫度保持24～26 ℃。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)4周。

1.2 藥品及藥液制備 SY方：半邊蓮20 g，敗醬草20 g，女貞子18 g，補(bǔ)骨脂15 g，王不留行15 g，三棱10 g，黃連10 g，白術(shù)10 g。中藥飲片購(gòu)置于北京仟草中藥飲片有限公司，飲片生產(chǎn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)藥典（2015年版）》，生產(chǎn)許可證號(hào)：京20150129。將中藥飲片混勻，用純水洗凈后再加入純水煎煮2次，冷凍、干燥、濃縮制成含藥濃度為1 g/ml湯劑（低劑量）、3 g/ml湯劑（中劑量）、6 g/ml湯劑（高劑量）。0.9%氯化鈉溶液為山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字：H37020765）。

1.3 主要試劑與儀器 檢測(cè)試劑盒：尿蛋白檢測(cè)試劑盒（南京建成，C035-2-1），尿肌酐檢測(cè)試劑盒（Bioassay，DICT-500），抗雙鏈DNA抗體（anti-dsDNA）檢測(cè)試劑盒（Alpha Diagnostic International，5120），抗核抗體（ANA）檢測(cè)試劑盒（Alpha Diagnostic International，5210），免染制膠試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司，1610185），BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Thermo，23225）。熒光抗體：C3（英國(guó)Abcam公司，ab4212），免疫球 蛋 白（Ig）G（Jackson，115-025-003），C5b-9（Bioss，bs-2673R-FITC）。WB一抗：α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）（Proteintech，55135）；Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ ）（Proteintech，14695）；Fibronectin（Proteintech，15613）；C3（Proteintech，21773-1-AP）；C5（GeneTex，GTX33052）；CD35（Genetex，GTX37450）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（Proteintech，10494-1-AP）；WB二 抗（ 碧 云 天，A0208）。儀器：真空冷凍干燥饑（上?？婆d儀器有 限 公 司，ZLGJ-10）， 酶 標(biāo) 儀（TECAN，SPARK 30086376），光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯，BX53F），共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，F(xiàn)V1000-D）；組織研磨儀（QIAGEN，tissuelyserⅡ），超聲波破碎儀（SonicsVibra-Cell），蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo），蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司，PowerPac Basic），成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，Chemidoc MP）。

1.4 動(dòng)物干預(yù)治療 以各組對(duì)應(yīng)劑量灌胃，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與成人體表面積換算法，確定復(fù)方SY干預(yù)劑量如下：SY低劑量組為15.34 g/kg，SY中劑量組為46.02 g/kg、SY高劑量組為92.04 g/kg，MRL/lpr組及正常對(duì)照組給予每日0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃。于小鼠第12周齡時(shí)開始干預(yù)，持續(xù)干預(yù)14周，1次/d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 動(dòng)物體征 觀察小鼠取材前毛色、皮損情況、精神狀態(tài)、脾臟大小、體質(zhì)量等情況，體質(zhì)量用電子秤稱量。采用體征分?jǐn)?shù)量化動(dòng)物體征，體征量化評(píng)分細(xì)則：（1）頭面部皮損累及胡須計(jì)1分，累及皮毛計(jì)1分，累及軀干計(jì)1分；（2）SY各劑量組及MRL/lpr組脾臟與同周齡正常對(duì)照組脾臟長(zhǎng)度均數(shù)相比，長(zhǎng)度每增加0.1 cm計(jì)0.1分；（3）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（小鼠26周齡）體質(zhì)量與起始（小鼠12周齡）體質(zhì)量差值，終點(diǎn)體質(zhì)量每下降0.1 g計(jì)0.1分，增加0.1 g計(jì)-0.1分。體征量化分值越小，表明狼瘡損傷越小。

1.5.2 尿蛋白檢測(cè) 于給藥第9、10、11、12、13周收取隨機(jī)尿，采用考馬斯亮藍(lán)（CBB法）檢測(cè)尿蛋白，根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作，使用酶標(biāo)儀在光密度（OD）595 nm、光徑1 cm處測(cè)定OD值，計(jì)算尿蛋白濃度。

1.5.3 尿肌酐檢測(cè) 于給藥第9、10、11、12、13周收取隨機(jī)尿，采用苦味酸法檢測(cè)尿肌酐，根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作，使用酶標(biāo)儀在OD 520 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算尿肌酐濃度。結(jié)合尿蛋白、尿肌酐結(jié)果，計(jì)算小鼠尿蛋白與尿肌酐比值（UPCR）。

1.5.4 血清anti-dsDNA、ANA濃度檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)anti-dsDNA、ANA濃度。干預(yù)14周后處死動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取全血，室溫靜置30 min后，3 000 r/min、20 min離心，收集上層透明血清樣本。根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作，使用酶標(biāo)儀在OD 405 nm處測(cè)定OD值。

1.5.5 腎臟組織病理檢查 干預(yù)14周后處死小鼠進(jìn)行取材，取腎臟組織于4%多聚甲醛溶液（4%PFA溶液）中固定48 h后，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，包埋，石蠟切片（2 μm），蘇木素-伊紅染色（HE染色）及高碘酸—希夫染色（PAS染色），封固后采用普通光學(xué)顯微鏡觀察，并通過(guò)圖像采集系統(tǒng)采集圖像。

1.5.6 C3、免疫球蛋白G（IgG）、C5b-9免疫熒光染色 取腎臟組織于4%PFA溶液中固定48 h后，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，冰凍切片（4 μm），透化、封閉、抗體（直標(biāo)）孵育、洗滌、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片，采用共聚焦顯微鏡觀察，通過(guò)圖像采集系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件對(duì)各組熒光強(qiáng)度（IOD）進(jìn)行半定量分析。

1.5.7 腎臟組織靶標(biāo)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法對(duì)腎臟組織靶標(biāo)蛋白進(jìn)行半定量分析。組織樣本中加入RIPA裂解液，研磨粉碎，超聲波破碎儀裂解腎臟細(xì)胞，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液，采用BCA法測(cè)樣本蛋白濃度并配平，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（1∶1 000）孵育、二抗（1∶1 000）孵育（括號(hào)內(nèi)為稀釋比例），一抗靶標(biāo)蛋白為α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、C3、C5、CD35、GAPDH，顯影成像。使用Image J軟件對(duì)各組靶標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料首先進(jìn)行Shapiro-wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，其中正常對(duì)照組和SY各劑量組分別與MRL/lpr組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，其中正常對(duì)照組和SY各劑量組分別與MRL/lpr組比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況對(duì)比 截至給藥結(jié)束，正常對(duì)照組6只小鼠存活，MRL/lpr組3只小鼠存活，SY低、中、高劑量組分別有5、7、9只小鼠存活。

自干預(yù)第8周起，MRL/lpr組和SY各劑量組小鼠開始出現(xiàn)不同程度的皮損；與MRL/lpr組相比，SY各劑量組小鼠頭面部及軀干部皮損較輕（圖1）。SY各劑量組小鼠脾臟長(zhǎng)度明顯小于MRL/lpr組（圖1）。

圖1 26周齡不同組小鼠的體征圖Figure 1 Signs of 26-week-old mice in five groups

5組小鼠體征量化分值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常對(duì)照組、SY中劑量組、SY高劑量組小鼠體征量化分值均低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠體征量化分值比較（±s，分）Table 1 Comparison of quantitative scores of signs of mice in five groups

表1 5組小鼠體征量化分值比較（±s，分）Table 1 Comparison of quantitative scores of signs of mice in five groups

注：a表示與MRL/lpr組相比P＜0.01；SY=腎怡

組別 只數(shù) 體征量化分值正常對(duì)照組 6 -4.73±1.69a MRL/lpr組 3 5.37±2.04 SY低劑量組 5 1.46±1.51 SY中劑量組 7 -2.13±2.23a SY高劑量組 9 -0.15±2.49a F值 13.96 P值 ＜0.001

2.2 5組小鼠干預(yù)第9、10、11、12、13周UPCR比較

5組小鼠干預(yù)第9、10、11、12、13周UPCR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組、SY各劑量組小鼠干預(yù)第9、10、11、12、13周UPCR均低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 5組小鼠干預(yù)第9、10、11、12、13周UPCR比較（±s）Table 2 Comparison of UPCR among 5 groups at 9，10，11，12 and 13 weeks after intervention

表2 5組小鼠干預(yù)第9、10、11、12、13周UPCR比較（±s）Table 2 Comparison of UPCR among 5 groups at 9，10，11，12 and 13 weeks after intervention

注：a表示與MRL/lpr組相比P＜0.001；MRL/lpr組及SY各劑量組數(shù)據(jù)有缺失

干預(yù)第1 3周正常對(duì)照組 6 0.2 0±0.1 1 a 0.4 0±0.0 2 a 0.2 8±0.0 3 a 0.1 9±0.0 7 a 0.3 9±0.0 5 a M R L/l p r組 3 0.6 9±0.2 6 0.8 8±0.3 3 0.8 4±0.3 0 0.9 0±0.1 2 0.9 0±0.1 7 S Y 低劑量組 5 0.3 2±0.0 2 a 0.4 6±0.0 6 a 0.3 6±0.0 7 a 0.2 7±0.1 0 a 0.4 5±0.1 0 a S Y 中劑量組 7 0.2 7±0.0 3 a 0.4 3±0.1 4 a 0.3 6±0.0 4 a 0.4 5±0.2 5 a 0.4 3±0.0 5 a S Y 高劑量組 9 0.2 5±0.0 7 a 0.5 2±0.2 4 a 0.3 3±0.0 5 a 0.3 4±0.1 4 a 0.4 6±0.0 9 a F值 1 3.5 8 3.1 3 1 2.8 0 1 4.5 4 2 0.9 7 P 值 ＜0.0 0 1 0.0 4 7 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1組別 只數(shù)干預(yù)第9周干預(yù)第1 0周干預(yù)第1 1周干預(yù)第1 2周

2.3 5組小鼠干預(yù)14周后血清anti-dsDNA、ANA水平比較 5組小鼠干預(yù)14周后血清anti-dsDNA、ANA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組、SY低劑量組、SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后血清anti-dsDNA水平低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組、SY各劑量組小鼠干預(yù)14周后血清ANA水平低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 5組小鼠干預(yù)14周后血清anti-dsDNA、ANA水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum anti-dsDNA and ANA levels in five groups of mice after 14 weeks of intervention

表3 5組小鼠干預(yù)14周后血清anti-dsDNA、ANA水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum anti-dsDNA and ANA levels in five groups of mice after 14 weeks of intervention

注：a表示與MRL/lpr組相比P＜0.05；MRL/lpr組及SY各劑量組數(shù)據(jù)有缺失；anti-dsDNA=抗雙鏈DNA抗體，ANA=抗核抗體

組別 只數(shù) anti-dsDNA ANA正常對(duì)照組 6 0.76±0.21a 0.24±0.02a MRL/lpr組 3 1.53±0.04 0.50±0.06 SY低劑量組 5 1.18±0.06a 0.34±0.04a SY中劑量組 7 1.59±0.05 0.33±0.04a SY高劑量組 9 1.19±0.16a 0.34±0.02a F值 25.06 23.79 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織病理結(jié)果 干預(yù)14周后，HE染色可見MRL/lpr組小鼠腎小球內(nèi)有免疫復(fù)合物沉積，PAS染色可見腎小球內(nèi)有新月體形成；HE染色可見SY各劑量組小鼠腎小球大致正常，而PAS染色可見SY中、高劑量組小鼠腎小球內(nèi)有系膜細(xì)胞增生，伴少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。

圖2 5組小鼠腎臟組織病理圖（400×）Figure 2 HE and PAS staining results of kidney tissue in each group of mice

2.5 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織C3、IgG、C5b-9免疫沉積比較 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織C3、IgG、C5b-9免疫沉積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組、SY各劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織C3、C5b-9沉積低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SY低劑量組、SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織IgG免疫沉積低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖3～5。

圖3 5組小鼠腎臟組織C3熒光檢測(cè)結(jié)果Figure 3 Fluorescence detection of C3 deposition in kidney tissues of 5 groups of mice

表4 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織C3、IgG、C5b-9免疫沉積比較Table 4 Comparison of immune deposition of C3，IgG and C5b-9 in kidney tissue of 5 groups of mice after 14 weeks of intervention

2.6 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin及補(bǔ)體蛋白水平比較 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織α-SMA蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織CollagenⅠ、Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織CollagenⅠ、Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SY低、中劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5、圖6。SY對(duì)小鼠腎臟組織補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)的影響通路圖見圖7。

圖6 SY對(duì)小鼠腎臟組織α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin及補(bǔ)體蛋白影響的電泳圖Figure 6 Electropherogram of the effect of Fufangshenyi Decoction on α-SMA，CollagenⅠ，fibronectin and complement proteins in the kidney tissue of the mouse model of lupus nephritis

圖7 SY對(duì)小鼠腎臟組織補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)的影響通路圖Figure 7 Pathway map of the effect of Fufangshenyi Decoction on the regulation of complement proteins in the kidney tissue of the mouse model of lupus nephritis

表5 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin及補(bǔ)體蛋白水平比較（±s）Table 5 Comparison of the levels of α-SMA，Collagen Ⅰ，fibronectin and complement protein in kidney tissue of 5 groups of mice after 14 weeks of intervention

表5 5組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin及補(bǔ)體蛋白水平比較（±s）Table 5 Comparison of the levels of α-SMA，Collagen Ⅰ，fibronectin and complement protein in kidney tissue of 5 groups of mice after 14 weeks of intervention

注：a表示與MRL/lpr組相比P＜0.05；MRL/lpr組及SY各劑量組數(shù)據(jù)有缺失；α-SMA=α平滑肌肌動(dòng)蛋白，CollagenⅠ=Ⅰ型膠原蛋白

組別 只數(shù) α-SMA CollagenⅠ Fibronectin C3 C5 CD35正常對(duì)照組 6 0.66±0.32 0.59±0.08 0.19±0.04a 0.69±0.30 0.82±0.34 0.37±0.05a MRL/lpr組 3 1.23±0.71 0.96±0.13 0.83±0.02 0.92±0.19 0.84±0.17 0.92±0.07 SY 低劑量組 5 0.66±0.20 0.81±0.25 0.45±0.02a 0.28±0.14a 0.34±0.11a 0.31±0.01a SY 中劑量組 7 0.54±0.50 0.67±0.23 0.24±0.01a 0.34±0.16a 0.19±0.13a 0.65±0.02a SY 高劑量組 9 0.22±0.16a 0.20±0.03a 0.27±0.03a 0.19±0.08a 0.18±0.12a 0.20±0.02a F值 2.19 8.80 281.60 7.99 8.86 156.50 P值 0.144 0.003 ＜0.001 0.004 0.003 ＜0.001

3 討論

圖4 5組小鼠腎臟組織IgG熒光檢測(cè)結(jié)果Figure 4 Fluorescence detection of IgG deposition in kidney tissues of 5 groups of mice

多項(xiàng)研究表明，補(bǔ)體旁路途徑的激活導(dǎo)致補(bǔ)體蛋白的表達(dá)異常，與SLE及LN的發(fā)病相關(guān)［11-13］。LN與補(bǔ)體激活相關(guān)的發(fā)病機(jī)制主要為：循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于腎小球毛細(xì)血管內(nèi)，激活機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)，介導(dǎo)過(guò)敏性毒素的釋放，進(jìn)而趨化免疫細(xì)胞聚集，釋放過(guò)氧化物及組織蛋白酶，補(bǔ)體系統(tǒng)激活后形成C5b-9，介導(dǎo)腎臟組織免疫損傷［14］。目前，臨床LN的治療主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主，但無(wú)論是哪種方案，均伴隨嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)。LN可歸屬為中醫(yī)學(xué)的“陰陽(yáng)毒”“紅蝴蝶瘡”及“虛勞”等范疇［15］。LN的中醫(yī)病機(jī)以虛、熱、瘀、毒為主，辨證論治以補(bǔ)腎虛，去邪熱，除瘀毒，特別以活血化瘀貫穿治療始末［16］。復(fù)方SY以三棱、王不留行為君，女貞子、白術(shù)為臣，半邊蓮、黃連、敗醬草、補(bǔ)骨脂為佐藥，功效為活血化瘀，補(bǔ)腎滋陰，清熱解毒，利水消腫?，F(xiàn)代藥理研究表明，復(fù)方SY具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腎臟系膜細(xì)胞增殖、腎小球硬化、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等作用［8-10］。

圖5 5組動(dòng)物腎臟組織C5b-9熒光檢測(cè)結(jié)果Figure 5 Fluorescence detection of C5b-9 deposition in kidney tissues of 5 groups of mice

本研究結(jié)果顯示，小鼠20周齡時(shí)，MRL/lpr組較SY各劑量組出現(xiàn)較為嚴(yán)重的皮損及體質(zhì)量減輕等類狼瘡癥狀，26周齡（實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)）癥狀加重，提示復(fù)方SY可抑制MRL/lpr小鼠的免疫亢進(jìn)，緩解類SLE癥狀體征。腎臟病理結(jié)果同時(shí)提示復(fù)方SY可改善MRL/lpr小鼠狼瘡腎臟損害。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、SY各劑量組小鼠干預(yù)第9、10、11、12、13周UPCR均低于MRL/lpr組，表明復(fù)方SY對(duì)MRL/lpr小鼠狼瘡腎損傷有保護(hù)作用，可能改善LN的預(yù)后。

血清anti-dsDNA、ANA水平是臨床診斷SLE、LN的參考指標(biāo)之一［17-19］。血清中anti-dsDNA、ANA水平與腎臟受累程度相關(guān)［20-21］。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、SY低劑量組、SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后血清anti-dsDNA水平低于MRL/lpr組，正常對(duì)照組、SY各劑量組小鼠干預(yù)14周后血清ANA水平低于MRL/lpr組；提示復(fù)方SY干預(yù)治療可降低小鼠血清ANA水平，而經(jīng)過(guò)復(fù)方SY低劑量及高劑量治療可降低小鼠血清anti-dsDNA水平，進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)方SY可能降低MRL/lpr小鼠血清自身抗體含量，緩解腎臟免疫受累。

免疫球蛋白與補(bǔ)體蛋白在腎臟的沉積可作為L(zhǎng)N免疫損傷嚴(yán)重程度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。各組小鼠腎臟組織C3、IgG、C5b-9免疫熒光染色及IOD半定量分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、SY各劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織C3、C5b-9沉積低于MRL/lpr組，SY低劑量組、SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織IgG免疫沉積低于MRL/lpr組；提示復(fù)方SY干預(yù)可減少腎臟組織補(bǔ)體和免疫球蛋白沉積，緩解腎臟組織免疫炎性損傷。本研究結(jié)果還顯示，SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織CollagenⅠ、Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr組，正常對(duì)照組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高劑量復(fù)方SY的干預(yù)可能延緩LN腎臟纖維化進(jìn)展。

補(bǔ)體系統(tǒng)作為生物體內(nèi)的非特異性免疫系統(tǒng)，與SLE、LN發(fā)病相關(guān)［2-3］。ELLIOTT等［22］、WATANABE等［23］關(guān)于SLE與補(bǔ)體因子的研究推翻了長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為的補(bǔ)體系統(tǒng)主要是通過(guò)經(jīng)典途徑的激活而影響SLE的發(fā)病，旁路途徑的激活可能是SLE乃至LN發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。補(bǔ)體旁路途徑激活后，C3分解為C3a、C3b，C5分解為C5a、C5b，C5b與C6、C7、C8、C9結(jié)合成C5b-9，介導(dǎo)細(xì)胞非特異性免疫攻擊。補(bǔ)體分子依賴于與補(bǔ)體受體的結(jié)合而發(fā)揮作用，CD35是補(bǔ)體分子C3b、C4b的特異性受體，其表達(dá)量可間接反映補(bǔ)體途徑的激活情況。本研究結(jié)果顯示，SY高劑量組小鼠干預(yù)14周后腎臟組織C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr組，表明復(fù)方SY干預(yù)后C3、C5蛋白水平降低，提示復(fù)方SY可能抑制補(bǔ)體蛋白在腎臟沉積，甚至抑制補(bǔ)體蛋白的合成；CD35蛋白是C3b與C4b的受體，SY干預(yù)后，CD35表達(dá)水平降低，提示復(fù)方SY可能抑制補(bǔ)體途徑的激活；免疫熒光結(jié)果提示SY干預(yù)后的腎小球內(nèi)C5b-9表達(dá)水平降低，復(fù)方SY可能抑制補(bǔ)體旁路途徑激活，減輕補(bǔ)體介導(dǎo)的腎臟免疫損傷。綜上，復(fù)方SY三個(gè)劑量干預(yù)MRL/lpr小鼠均不同程度改善LN的腎臟免疫損傷，其中以SY高劑量干預(yù)改善較明顯。

本研究尚存在一定的不足：（1）中藥復(fù)方湯劑有效成分復(fù)雜，本研究未對(duì)復(fù)方SY中藥湯劑的單個(gè)有效成分進(jìn)行藥理分析。（2）中藥干預(yù)、治療疾病通常以多靶點(diǎn)、多通路機(jī)制發(fā)揮作用，本研究只在補(bǔ)體通路途徑進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證，對(duì)復(fù)方SY治療LN的機(jī)制研究尚不充分。（3）由于本研究藥物干預(yù)時(shí)間較長(zhǎng)，樣本量較少，各組動(dòng)物干預(yù)過(guò)程存在死亡等不確定性因素，導(dǎo)致存在數(shù)據(jù)缺失情況。在接下來(lái)針對(duì)中藥復(fù)方SY的深入研究中，上述的幾點(diǎn)研究不足將會(huì)被著重考慮。

綜上所述，本研究的優(yōu)勢(shì)在于系統(tǒng)性地闡述了復(fù)方SY對(duì)MRL/lpr小鼠LN的治療作用，并且從補(bǔ)體旁路途徑的激活方面驗(yàn)證復(fù)方SY緩解LN腎臟免疫損傷的治療機(jī)制，為未來(lái)臨床開發(fā)運(yùn)用復(fù)方SY治療LN提供了理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：陳鏗進(jìn)行研究的設(shè)計(jì)及實(shí)施，研究數(shù)據(jù)的收集及整理、統(tǒng)計(jì)分析、繪制圖表，文章的構(gòu)思及撰寫；鄧翼遙進(jìn)行研究的規(guī)劃設(shè)計(jì)及論文修訂；尚順來(lái)進(jìn)行部分?jǐn)?shù)據(jù)整理；李清剛、陳香美對(duì)研究提出概念并監(jiān)督研究活動(dòng)的規(guī)劃和執(zhí)行；陳香美負(fù)責(zé)最終版本修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。