透明質(zhì)酸寡糖通過影響核因子E2相關(guān)因子2信號通路促進糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的機制研究

胡鐘元 ，張秀華 ，李帥廣 ，3，邵華榮 ，劉飛 ，3*，郭斌

糖尿病是世界范圍內(nèi)常見和嚴(yán)重的慢性疾病之一。根據(jù)《國際糖尿病聯(lián)合會》第10版報告，2021年全球20～79歲人群糖尿病患病率為10.5%（5.366億），預(yù)計2045年將上升至12.2%（7.832億）［1］。糖尿病皮膚潰瘍（diabetic cutaneous ulcer，DCU）是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，致殘率高、治療費用昂貴［2-3］。糖尿病狀態(tài)下氧化應(yīng)激水平過高是DCU患者創(chuàng)面難愈的重要原因，影響創(chuàng)面愈合的各個階段，嚴(yán)重者發(fā)生感染，甚至截肢［3-5］。因此，調(diào)節(jié)機體氧化還原平衡、促進血管新生從而加速創(chuàng)面愈合是加快糖尿病創(chuàng)面愈合的潛在治療方法。

透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）是細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的一種高分子糖胺聚糖，由重復(fù)的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺二糖單元組成，其功能與其分子量直接相關(guān)［6］。目前已有研究證實透明質(zhì)酸寡糖（hyaluronic acid oligosaccharide，o-HA）（相對分子質(zhì)量＜10 kDa）可通過增強血管生成促進創(chuàng)面愈合，對急性創(chuàng)面有修復(fù)作用［7］。本課題組前期研究也證實o-HA可刺激血管生成、加速創(chuàng)面重新上皮化、促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合［8］，但其促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的機制研究尚不深入。為促進o-HA的進一步開發(fā)，本研究擬建立DCU模型，探究o-HA對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只雄性SPF級昆明小鼠，6周齡，體質(zhì)量（22±2）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190003。小鼠飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%。經(jīng)山東省藥學(xué)科學(xué)院-藥物安全評價中心實驗動物管理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批準(zhǔn)試驗（編號：IACUC-2021-004）。實驗時間為2021年4—12月。

1.2 藥物與試劑 o-HA由山東省藥學(xué)科學(xué)院自制［9］（重均分子量：2.7 kDa，批號：20201021）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（北京博愛港生物技術(shù)有限公司）；活檢穿孔器（Kai medical），黏合劑（Krazy，744-3514），RIPA裂 解 液（radioimmunoprecipitation lysis buffer，RIPA）和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0013B，ST506）；β-肌動蛋白（β-action）（Cell Signaling，8457）；核因子E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）（Proteintech，16396-1-AP），血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）（Cell Signaling，86806），NAD（P）H 醌 氧化 還 原酶 1〔NAD（P）H quinone oxidoreductase 1，NQO1〕（Cell Signaling，3187）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（中杉金橋，ZB-2301），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（中杉金橋，ZB-2305）；血糖儀（歐姆龍HGM-112型）；血糖試紙（歐姆龍AS1型）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、 丙 二 醛（malonic dialdehyde，MDA）檢測試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）。

1.3 o-HA軟膏的制備 采用乳化法制備o-HA軟膏，即將6.0 g黃凡士林、6.3 g硬脂酸、4.8 g單硬脂酸甘油酯、7.5 g液狀石蠟75 ℃加熱至融化制成油相，將6.0 g甘油、0.60 g十二烷基硫酸鈉、0.075 g尼泊金甲酯、28.8 ml蒸餾水80 ℃加熱至融化制成水相Ⅰ，向水相Ⅰ中加入0.3 g o-HA（0.5%）/0.6 g o-HA（1%）/1.2 g o-HA（2%）制成水相Ⅱ，水相Ⅱ緩慢加入油相中分別制備低、中、高劑量o-HA軟膏，邊加邊攪拌，直至冷凝。

1.4 糖尿病小鼠模型及創(chuàng)面模型的建立 參考文獻［10］構(gòu)建糖尿病小鼠模型，所有小鼠于造模前1 d禁食不禁水16 h，次日上午尾部采血測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）后，以150 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ以誘發(fā)糖尿病。所有小鼠每周檢測FBG水平（禁食6 h），2次或2次以上FBG≥16.7 mmol/L判定為造模成功。

高血糖狀態(tài)持續(xù)6周后造成慢性糖尿病狀態(tài)，所有小鼠利用全層皮膚切除環(huán)形夾板法建立創(chuàng)面模型［11-13］（圖1）。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉，將小鼠脊柱兩側(cè)皮膚的毛發(fā)去除干凈，使用75%酒精對造模處皮膚進行消毒，以脊柱為中線捏起小鼠背部皮膚，使用直徑6 mm的皮膚活檢打孔器按壓形成兩個對稱的圓形全層皮膚切除創(chuàng)口，用黏合劑將硅膠夾板固定在創(chuàng)面周圍，用5-0縫合線縫合后用無菌透明敷料覆蓋創(chuàng)面。實驗中共80只小鼠注射STZ，10只因血糖過低或過高死亡，5只造模未成功，2只出現(xiàn)并發(fā)癥，3只體質(zhì)量過輕，均未納入分組。

圖1 創(chuàng)面模型的建立Figure 1 Establishment of the wound model

1.5 實驗分組及給藥 未注射STZ（注射同等劑量枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液）的血糖正常的10只小鼠作為正常對照組（normal control，NC組）。糖尿病模型建造成功的小鼠按照隨機數(shù)字表法分為6組：糖尿病模型組（diabetic model，DM組）、重組人表皮生長因子陽性對照組（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF組）、空白基質(zhì)陰性對照組（matrix組）、低劑量o-HA治療組（0.5% o-HA組）、中劑量o-HA治療組（1% o-HA組）、高劑量o-HA治療組（2% o-HA組），每組10只。NC組和DM組小鼠創(chuàng)面不做任何處理，其他各組每日創(chuàng)面及創(chuàng)周常規(guī)消毒后，均勻涂抹o-HA軟膏于創(chuàng)面及創(chuàng)周，rhEGF組給藥1次/d，0.5%、1%、2%o-HA組給藥2次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 創(chuàng)面愈合分析 第1、7、14天用相機對創(chuàng)面閉合區(qū)域進行追蹤，用Image J對創(chuàng)面愈合面積進行量化，得到創(chuàng)面愈合率，公式為：創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.6.2 創(chuàng)面組織蘇木素-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色、馬松三色（Masson trichrome，Masson）染色和CD34免疫組化染色觀察 連續(xù)給藥14 d后，取小鼠創(chuàng)面及創(chuàng)周皮膚組織，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋進行HE染色、Masson染色和免疫組化染色，于光鏡下進行觀察。通過HE染色觀察創(chuàng)面肉芽組織形態(tài)學(xué)變化，通過Masson染色觀察創(chuàng)面組織真皮層膠原纖維沉積情況，通過CD34免疫組化染色觀察o-HA對創(chuàng)面新生血管的影響。CD34多用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，血管腔內(nèi)一層連續(xù)或不連續(xù)的陽性著色帶，即為染色的內(nèi)皮細胞。利用CD34免疫組化染色對小鼠創(chuàng)面新生血管密度進行評估，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算免疫組化切片照片的陽性細胞數(shù)，除以細胞總數(shù)，即為每張免疫組化切片的陽性細胞率。

1.6.3 血清MDA、SOD水平分析 末次給藥后各組小鼠分別摘眼球取全血，室溫靜置1 h，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8.6 cm，取上層血清，使用相應(yīng)的試劑盒檢測血清SOD、MDA水平。

1.6.4 Western-blotting法檢測創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達 連續(xù)給藥14 d后，取小鼠創(chuàng)面及創(chuàng)周皮膚組織，置于1.5 ml凍存管中，液氮速凍后-80 ℃深低溫冰箱保存。實驗時將創(chuàng)面組織于-80 ℃取出，冰上解凍并稱重，剪碎后放于EP管中，按照每20 mg組織加入100 μl裂解液（含1% PMSF）的比例加入RIPA裂解液。功率400 W，冰水浴超聲5 s，間隔30 s，次數(shù)4次。充分勻漿后，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8.6 cm。吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脫脂奶粉中封閉1 h，TBST緩沖液（TBS with Tween-20，TBST）清洗3次，加入一抗（Nrf2按1∶2 000稀釋，HO-1、NQO1、β-actin按1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次。隨后，加入1：20 000稀釋的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗，在室溫下孵育1 h，TBST清洗3次，增強型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑進行顯色。Image J軟件對條帶進行定量分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該蛋白的相對表達量，對結(jié)果進行歸一化后進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad prism 8.4.2.679軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠造模情況 第0周時，正常對照小鼠和糖尿病模型小鼠體質(zhì)量、FBG比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第2、4、6、8周時，糖尿病模型小鼠體質(zhì)量低于正常對照小鼠，F(xiàn)BG高于正常對照小鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、2。每周檢測糖尿病模型小鼠FBG均＞16.7 mmol/L，且體質(zhì)量增長緩慢，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、毛發(fā)暗黃的表現(xiàn)，認(rèn)定糖尿病模型構(gòu)建成功。體內(nèi)實驗時間線見圖2。

圖2 DCU體內(nèi)實驗時間線Figure 2 Timeline of in vivo experiments for diabetic cutaneous ulcer

表1 兩組小鼠不同時間點體質(zhì)量比較（±s，g）Table 1 Comparison of weight level between two groups of mice at different time

表1 兩組小鼠不同時間點體質(zhì)量比較（±s，g）Table 1 Comparison of weight level between two groups of mice at different time

組別 只數(shù) 第0周 第2周 第4周 第6周 第8周正常對照小鼠 10 25.06±0.58 35.07±0.63 42.58±0.53 46.84±1.10 48.96±0.78糖尿病模型小鼠 60 26.63±0.51 25.72±0.83 25.67±0.58 25.57±0.80 24.82±0.90 t值 2.04 8.96 21.54 15.59 20.29 P 值 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 o-HA對DCU小鼠創(chuàng)面愈合的影響 給藥第7、14天，各組小鼠創(chuàng)面愈合率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中給藥第7天，DM組、matrix組創(chuàng)面愈合率低于NC組，rhEGF組、1% o-HA組創(chuàng)面愈合率高于DM組，0.5% o-HA組、2% o-HA組創(chuàng)面愈合率低于NC組、高于DM組；給藥第14天，DM組、matrix組創(chuàng)面愈合率低于NC組，rhEGF組、0.5% o-HA組、1%o-HA組、2% o-HA組創(chuàng)面愈合率高于DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 創(chuàng)傷后各組小鼠創(chuàng)面愈合情況比較Figure 3 Comparison of wound healing in each group after trauma

表3 各組小鼠創(chuàng)傷后不同時間創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）Table 3 Comparison of wound healing rate in each group of mice at different time points after trauma

表3 各組小鼠創(chuàng)傷后不同時間創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）Table 3 Comparison of wound healing rate in each group of mice at different time points after trauma

注：NC組=正常對照組，DM組=糖尿病模型組，rhEGF組=重組人表皮生長因子陽性對照組，matrix組=空白基質(zhì)陰性對照組，o-HA=透明質(zhì)酸寡糖；a表示與NC組相比P＜0.05，b表示與DM組相比 P＜0.05

組別 只數(shù) 第7天 第14天NC組 10 56.52±1.55 93.57±3.15 DM 組 10 29.89±5.27a 75.56±5.12a rhEGF 組 10 55.91±0.83b 90.17±1.12b matrix組 10 36.92±0.53a 82.91±0.98a 0.5% o-HA組 10 43.92±0.86ab 88.02±1.60b 1% o-HA 組 10 51.79±1.48b 92.92±1.39b 2% o-HA 組 10 47.50±2.64ab 88.17±1.08b F值 16.81 6.29 P值 ＜0.01 ＜0.05

表2 兩組小鼠不同時間點FBG比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of fasting blood glucose level between two groups of mice at different time

表2 兩組小鼠不同時間點FBG比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of fasting blood glucose level between two groups of mice at different time

組別 只數(shù) 第0周 第2周 第4周 第6周 第8周正常對照小鼠 10 7.69±0.24 10.71±0.56 8.16±0.28 8.77±0.38 8.61±0.36糖尿病模型小鼠 60 7.24±0.22 28.15±0.71 30.75±0.36 30.08±0.64 29.57±0.89 t值 1.36 19.23 49.10 28.59 21.70 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 o-HA對DCU小鼠創(chuàng)面肉芽組織形成、膠原纖維沉積的影響 HE染色結(jié)果顯示，DM組小鼠創(chuàng)面直徑最寬，與DM組相比，o-HA和rhEGF處理的小鼠創(chuàng)面直徑顯著減小，不同劑量o-HA處理創(chuàng)面直徑無顯著差別，matrix組創(chuàng)面相對較寬；NC組小鼠創(chuàng)面上皮細胞結(jié)構(gòu)正常，真皮層膠原纖維排列整齊；與DM組和matrix組相比，rhEGF組新生肉芽組織幾乎取代所有壞死組織，0.5% o-HA組新生血管逐漸閉合，炎性細胞浸潤減少，1% o-HA組和2% o-HA組新生表皮較厚，成纖維細胞與纖維細胞數(shù)量增多，膠原纖維生成較多（圖4）。

圖4 創(chuàng)傷后14 d各組小鼠創(chuàng)面組織HE染色Figure 4 Wound tissue of mice in each group was stained with H&E on day 14 after trauma

Masson染色結(jié)果顯示，DM組創(chuàng)面藍染少、著色淺，膠原纖維分布稀疏，排列紊亂；不同劑量的o-HA組藍染多，著色深，創(chuàng)面膠原纖維排列規(guī)則有序，2% o-HA組藍染較0.5% o-HA組和1% o-HA組淺，膠原纖維生成情況較差。組織形態(tài)學(xué)分析顯示o-HA治療后肉芽組織、膠原纖維生成增多，表皮結(jié)構(gòu)趨于完整（圖5）。

圖5 創(chuàng)傷后14 d各組小鼠創(chuàng)面組織Masson染色Figure 5 Wound tissue of mice in each group was stained by Masson on day 14 after trauma

2.4 o-HA對DCU小鼠創(chuàng)面組織新生血管密度的影響

NC組棕色CD34陽性細胞率為（13.40±0.47）%，DM組為（6.34±0.37）%，rhEGF組為（12.62±0.70）%，matrix組 為（6.01±1.35）%，0.5% o-HA組 為（11.56±0.30）%，1% o-HA組為（14.28±2.26）%，2%o-HA組為（12.68±1.83）%，各組棕色CD34陽性細胞率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.162，P=0.001）。其中DM組、matrix組CD34陽性細胞率低于NC組，rhEGF組、0.5% o-HA組、1% o-HA組、2% o-HA組CD34陽性細胞率高于DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

各給藥組新生血管排列規(guī)律，管腔狹長，呈梭形，1% o-HA組新生血管較為明顯；DM組及matrix組血管雜亂，零星分布，且大部分新生血管較細。免疫組化結(jié)果顯示o-HA對創(chuàng)面周圍血管、毛細血管有明顯的刺激作用，見圖6。

圖6 各組小鼠創(chuàng)面組織CD34免疫組化染色Figure 6 Immunohistochemical staining of CD34 in wound tissue of mice in each group

2.5 o-HA對DCU小鼠的抗氧化作用 各組小鼠MDA、SOD水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中DM組、matrix組MDA水平高于NC組、SOD水平低于NC組；rhEGF組MDA水平低于DM組，SOD水平低于NC組、高于DM組；0.5% o-HA組MDA水平高于NC組、低于DM組，SOD水平高于DM組；1% o-HA組MDA水平低于DM組，SOD水平高于DM組；2% o-HA組MDA水平高于NC組、低于DM組，SOD水平低于NC組、高于DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）Table 4 Comparison of SOD and MDA levels in serum of each group

表4 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）Table 4 Comparison of SOD and MDA levels in serum of each group

注：a表示與NC組相比P＜0.05，b表示與DM組相比P＜0.05；MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶

組別 只數(shù) MDA（nmol/ml） SOD（U/ml）NC 組 10 4.13±0.86 163.40±2.65 DM 組 10 15.00±0.29a 61.34±1.73a rhEGF 組 10 8.85±0.96b 110.10±1.62ab matrix組 10 12.67±0.38a 80.51±3.23a 0.5% o-HA 組 10 10.22±1.19ab 120.90±8.05b 1% o-HA組 10 6.18±0.10b 136.30±11.15b 2% o-HA組 10 10.35±0.65ab 105.70±2.05ab F值 34.22 37.23 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.6 o-HA對DCU小鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達的影響 各組小鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中DM組Nrf2、NQO1蛋白表達水平低于NC組；rhEGF組、1% o-HA組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平均高于NC組和DM組；0.5% o-HA組Nrf2、NQO1蛋白表達水平高于DM組，HO-1蛋白表達水平高于NC組和DM組；2% o-HA組HO-1蛋白表達水平高于NC組和DM組，NQO1蛋白表達水平高于DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5、圖7。o-HA促進DCU小鼠創(chuàng)面愈合的機制見圖8。

圖7 各組小鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達Figure 7 Expression of Nrf2，HO-1 and NQO1 proteins in wound tissue of each group

圖8 o-HA影響Nrf2信號通路促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合Figure 8 o-HA affects Nrf2 signaling pathway and promote wound healing in diabetic mice

表5 各組小鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量（±s）Table 5 The relative expression of Nrf2，HO-1 and NQO1 protein in wound tissue of each group

表5 各組小鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量（±s）Table 5 The relative expression of Nrf2，HO-1 and NQO1 protein in wound tissue of each group

注：a表示與NC組相比P＜0.05，b表示與DM組相比P＜0.05；Nrf2=核因子E2相關(guān)因子2，HO-1=血紅素加氧酶1，NQO1=NAD（P）H醌氧化還原酶1

組別 只數(shù) Nrf2 HO-1 NQO1 NC 組 10 1.10±0.11 1.06±0.10 1.08±0.07 DM 組 10 0.81±0.04a 1.11±0.04 0.67±0.03a rhEGF 組 10 1.41±0.05ab 2.47±0.13ab 2.13±0.05ab matrix組 10 0.88±0.01 1.40±0.15 0.90±0.05 0.5% o-HA 組 10 1.23±0.11b 1.83±0.02ab 1.16±0.10b 1% o-HA 組 10 1.42±0.03ab 2.49±0.06ab 1.77±0.09ab 2% o-HA 組 10 0.89±0.04 2.34±0.06ab 1.20±0.04b F值 14.32 47.61 58.30 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

目前，治療糖尿病難愈創(chuàng)面的方法主要是在控制血糖的基礎(chǔ)上預(yù)防感染，減輕創(chuàng)面炎性反應(yīng)。對于一些新興療法如生長因子療法、干細胞治療，雖然效果顯著，但是存在治療成本高、具有誘導(dǎo)炎癥和免疫原性的局限性，因此，對于DCU的治療，亟需更安全、有效的藥物。o-HA由HA經(jīng)酶解而成，具有促進血管新生的生物活性，從而可以促進創(chuàng)面愈合［14］。雖然文獻已報道o-HA可通過增加創(chuàng)面處細胞酪氨酸激酶（steroid recep-tor coactivator，Src）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）磷酸化以及轉(zhuǎn)化生長因子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達，促進糖尿病創(chuàng)面愈合［8］，但是關(guān)于o-HA在DCU創(chuàng)面愈合抗氧化作用及氧化應(yīng)激的機制研究很少。

DCU的發(fā)病機制比較復(fù)雜，高血糖引發(fā)的氧化應(yīng)激水平升高是其中重要方面，而Nrf2通路是重要的抗氧化應(yīng)激信號通路，本研究采用腹腔注射STZ的方法誘導(dǎo)糖尿病，建立全層皮膚缺損環(huán)形夾板模型，研究o-HA對DCU創(chuàng)面愈合的作用及氧化應(yīng)激的影響。該模型將環(huán)形硅膠夾板緊緊貼附在小鼠創(chuàng)面周圍皮膚上，以減少創(chuàng)面皮膚收縮的影響，使小鼠創(chuàng)面最大程度通過肉芽組織生成均勻閉合，從而使創(chuàng)面愈合更接近糖尿病患者創(chuàng)面愈合方式。本研究結(jié)果證實o-HA可加速創(chuàng)面肉芽組織生成、增加膠原纖維沉積、加快新生血管生成從而促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，改善DCU。此外，本研究結(jié)果顯示中劑量o-HA軟膏對糖尿病創(chuàng)面愈合的治療效果最佳，和rhEGF凝膠治療糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的愈合率幾乎相同，低劑量與高劑量o-HA軟膏治療效果均不如中劑量組，分析原因可能是給藥前需對創(chuàng)面進行消毒清洗，而o-HA濃度越大，越容易在創(chuàng)面部位形成干膏，清洗不到位，影響藥物的二次吸收，清洗過度，創(chuàng)面容易撕裂，造成二次創(chuàng)傷；另一方面，高劑量組軟膏覆蓋在創(chuàng)面表面，可能導(dǎo)致創(chuàng)面透氣性不理想。總之，本研究結(jié)果表明，o-HA對糖尿病創(chuàng)面具有較好的促愈合作用，表現(xiàn)為明顯減小創(chuàng)面面積，顯著提高創(chuàng)面愈合率，促進創(chuàng)面肉芽組織形成、膠原沉積以及增加毛細血管密度。

氧化應(yīng)激在糖尿病各系統(tǒng)并發(fā)癥中普遍存在，過高的氧化應(yīng)激水平會對機體中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成損傷，最終導(dǎo)致細胞死亡和組織功能障礙［15］。MDA是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，可作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，DM組MDA水平升高，經(jīng)o-HA處理后含量降低。SOD是機體抗氧化損傷酶系統(tǒng)的重要部分，SOD通過催化超氧自由基生成分子氧和過氧化氫來減輕氧化應(yīng)激［16］。本研究中DM組活力降低，o-HA治療后逆轉(zhuǎn)了糖尿病引起的總抗氧化能力下降。Nrf2信號通路在維持細胞內(nèi)氧化平衡方面起著重要作用，是糖尿病、阿爾茨海默病、心血管疾病、DCU、糖尿病腎病等疾病的藥物靶點［5］。Nrf2通過調(diào)節(jié)NQO1、HO-1等基因維持細胞氧化還原平衡。研究表明，Nrf2活化劑SFN可導(dǎo)致Nrf2的核轉(zhuǎn)移以及積累，并增加HO-1和NQO1在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的表達［17］。在糖尿病創(chuàng)面愈合中，創(chuàng)面中的活性氧（ROS）導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂、脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性以及糖尿病創(chuàng)面愈合受損，Nrf2及其下游抗氧化基因明顯減少。本研究進一步證實o-HA在抗氧化應(yīng)激方面的重要性，其可降低機體氧化應(yīng)激水平，升高Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表達水平，影響Nrf2信號通路促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合。然而，DCU發(fā)病機制復(fù)雜，本研究下一步將從能量代謝角度深入探討o-HA改善DCU的作用機制。

綜上所述，本研究證實o-HA可促進糖尿病創(chuàng)面愈合，其機制可能與影響Nrf2信號通路，加速創(chuàng)面閉合和再上皮化，刺激血管新生有關(guān)，具有開發(fā)為治療DCU藥物的重要潛力。

作者貢獻：胡鐘元負責(zé)實驗設(shè)計的實施、實驗指標(biāo)的檢測以及撰寫論文，并進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計學(xué)分析、繪制圖表；張秀華、李帥廣負責(zé)進行動物造模以及論文的修訂；邵華榮負責(zé)最終版本的修訂以及論文內(nèi)容的審校；劉飛、郭斌負責(zé)確定文章選題，指導(dǎo)實驗設(shè)計及論文撰寫。

本文無利益沖突。