三丁酸甘油酯對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88誘發(fā)的小鼠腸道損傷的緩解作用

龐麗麗 朱榮生 王懷中 王建才 齊 靜 黃保華 呼紅梅*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟南 250100；2.國家北京藥物安全評價研究中心，北京 100850)

仔豬腹瀉是生產(chǎn)中典型的多因素疾病，也是造成仔豬死亡的主要原因。仔豬腹瀉的病因和流行性病學(xué)非常復(fù)雜，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起仔豬腹瀉最常見的食源性流行病原體[1]。ETEC引起腹瀉主要與菌毛黏附素和腸毒素有關(guān)，它們促進病原菌黏附于腸上皮細胞，導(dǎo)致機體電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡和腸道菌群失調(diào)，損傷腸道正常形態(tài)，引發(fā)炎癥反應(yīng)[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，ETEC感染引起的仔豬腹瀉在國內(nèi)約占35%，在美國等其他國家約占45%，是導(dǎo)致生豬養(yǎng)殖業(yè)損失的重要因素[4-5]。目前抗生素療法是治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的主要措施，但是易反復(fù)和繼發(fā)感染，而且易導(dǎo)致動物腸道菌群失衡和腸壁損傷[6]。三丁酸甘油酯(tributyrin，TB)作為丁酸前體物，因其為腸道上皮細胞供能，刺激腸上皮細胞增殖等特點而受到關(guān)注[7]，其可改善腸道黏膜的營養(yǎng)狀態(tài)，修復(fù)抗生素、乙酸等因素導(dǎo)致的腸道損傷[6,8-9]。研究表明，飼糧中添加0.1%TB可促進腸道發(fā)育，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[10]，維持腸道菌群平衡[11-12]，提高免疫力，促進黏蛋白分泌，進而提高畜禽生產(chǎn)性能[13-18]；飼糧添加0.1%TB可顯著減緩乙酸和抗生素(甲硝唑、硫酸新霉素、萬古霉素，每日分別給藥1 g、500 mg、1 mg，連續(xù)7 d)誘發(fā)的腸道損傷[11-12]；給小鼠口服或灌腸TB，可減輕硫酸葡聚糖鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷和炎癥[19]。金霉素是治療細菌疾病的常用抗生素，飼糧中添加75 mg/kg金霉素可顯著降低仔豬腹瀉，提高生長性能[20]。目前，可通過腹腔注射、鼻飼、灌服大腸桿菌的方法建立穩(wěn)定的小鼠腹瀉模型。ETEC作為外源菌，感染后引起動物腹瀉、誘導(dǎo)腸道炎癥發(fā)生，腹瀉模型已成為研究外源菌感染誘發(fā)的腸炎、病原菌與宿主免疫系統(tǒng)相互關(guān)系、微生態(tài)制劑、益生菌等治療腸炎機制的理想模型[21]。目前對于TB是否能夠修復(fù)ETEC誘發(fā)的腸道損傷未見報道，為此，本試驗以ETEC K88誘導(dǎo)建立的小鼠腹瀉模型為載體，研究TB對ETEC K88誘發(fā)的小鼠腸道損傷的影響，為通過營養(yǎng)手段改善大腸桿菌誘發(fā)的腸道損傷，促進腸道屏障完善，減少腹瀉發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

選取體重相近的健康BCLB/c小鼠155只，體重為(20±2) g，由濟南新建生物技術(shù)有限公司提供。小鼠基礎(chǔ)飼糧由青島可奈爾飼料有限公司提供。試驗期間，試驗小鼠飼養(yǎng)于相對濕度在30%～40%的清潔動物籠中，自由采食、飲水。墊料高壓滅菌，每天更換1次。

1.1.2 ETEC K88

ETEC K88標(biāo)準株(CVCC196)購自中國菌種保存中心。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 ETEC K88誘發(fā)小鼠腹瀉模型的構(gòu)建

選擇體重相近的BALB/c小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。各組均飼喂基礎(chǔ)飼糧，在第4天對照組腹腔注射無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)0.5 mL，試驗1、2、3、4組分別腹腔注射濃度為5.5×108、4.9×107、4.0×106、6.5×105CFU/mL的ETEC K88懸液0.5 mL。連續(xù)觀察3 d，記錄小鼠的臨床癥狀、腹瀉數(shù)量和死亡數(shù)量。

1.2.2 TB對ETEC K88誘發(fā)的腸道損傷的緩解作用

選擇體重相近的BALB/c小鼠105只，隨機分為7組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)5只?？瞻讓φ战M、陰性對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，陽性對照組飼喂添加0.16%金霉素的基礎(chǔ)飼糧，試驗1、2、3、4組分別飼喂添加0.05%、0.10%、0.20%、0.30%TB的基礎(chǔ)飼糧，連續(xù)飼喂14 d。在第15天，空白組腹腔注射無菌PBS 0.5 mL，陰性對照組、陽性對照組和試驗1、2、3、4組按照1.2.1中確定的造模劑量腹腔注射ETEC K88懸液0.5 mL。連續(xù)觀察3 d，記錄小鼠的臨床癥狀、腹瀉和死亡數(shù)量，在注射后第4天采血并剖檢小鼠，觀察腸道病變。試驗小鼠分組和處理見表1。

表1 試驗小鼠分組及飼喂方案

1.3 檢測指標(biāo)

腹瀉模型構(gòu)建過程中觀察小鼠精神狀況、行動力、被毛、排便情況，記錄腹瀉、死亡數(shù)量。使用紫外分光光度計測定菌懸液在560 nm出的吸光度(OD560 nm)，確定菌懸液細菌濃度(OD560 nm=0.8時，細菌濃度約為108CFU/mL)。

在TB對ETEC K88誘發(fā)的腸道損傷的緩解作用試驗中連續(xù)觀察小鼠精神狀況、行動力、被毛狀況，記錄小鼠體重、采食情況。參考Swaggerty等[22]的方法對腸道病變進行評分并制作腸道組織病理切片，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法測定血清中二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性與內(nèi)毒素(endotoxin，ET)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用Graphpad prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用LSD法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準誤(SE)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ETEC K88誘發(fā)小鼠腹瀉模型的建立

對照組小鼠腹腔注射無菌PBS后2 h恢復(fù)行動能力，開始采食飲水，無腹瀉和死亡。試驗組小鼠腹腔注射ETEC K88懸液后出現(xiàn)不同程度的腹瀉，而且被毛逆立粗亂、精神沉郁、趴窩不動、反應(yīng)遲緩。試驗1、2、3、4組小鼠腹腔注射ETEC K88懸液濃度分別為5.5×108、4.9×107、4.0×106、6.5×105CFU/mL，小鼠的腹瀉率分別為100%、80%、20%、0%，死亡率分別為90%、20%、0%、0%，具體見表2。擬合小鼠腹瀉率和死亡率曲線，根據(jù)改良寇氏法計算得知半數(shù)致死劑量(LD50)為4.9×107CFU/mL，因此選擇腹腔注射4.9×107CFU/mL ETEC K88建立小鼠腹瀉模型，研究TB對ETEC K88誘發(fā)的腸道損傷的緩解作用。

表2 產(chǎn)腸毒大腸桿菌K88對小鼠腹瀉率和死亡率的影響

2.2 TB對ETEC K88誘發(fā)的小鼠腸道損傷的緩解作用

2.2.1 TB對小鼠增重的影響

由表3可知，各組試驗小鼠的初始體重相近，差異不顯著(P>0.05)。與陰性對照組相比，陽性對照組和試驗3、4組的平均日增重顯著增加(P<0.05)，分別提高了27.78%、25.00%和34.95%。陽性對照組和試驗3、4組的平均日增重均顯著高于試驗1、2組(P<0.05)，提高了17.65%～27.85%。

表3 TB對小鼠增重的影響

2.2.2 TB對小鼠腹瀉率和死亡率的影響

由表4可知，陰性對照組小鼠的腹瀉率和死亡率最高，分別達到53.33%和20.00%，其他各組均無死亡。其余各組中，試驗1組腹瀉率最高，達到33.33%，其次為陽性對照組和試驗2組，腹瀉率均為26.67%，試驗3、4組腹瀉率均為20.00%，空白對照組無腹瀉發(fā)生。由此可見，飼糧中添加TB和金霉素對ETEC K88誘發(fā)的小鼠腹瀉和死亡均有較好的預(yù)防和緩解作用，其中飼糧中添加0.20%、0.30%TB時效果明顯，優(yōu)于添加金霉素。

表4 TB對小鼠腹瀉率和死亡率的影響

2.2.3 TB對小鼠腸道組織病變的影響

剖檢正常、腹瀉和死亡小鼠，觀察腸道病理變化，并進行評估。死亡小鼠的腸道組織損傷比腹瀉小鼠嚴重，未發(fā)病小鼠腸道組織未見明顯病變。死亡小鼠空腸達到4級病變，大面積廣泛性出血；十二指腸2～3級病變，不同程度腫脹，分布出血帶；盲腸直腸1級病變，有肉眼可見出血點。腹瀉小鼠空腸3級病變，肉眼可見出血點，腸道有水樣填充物；十二指腸1～2級病變，腸壁充盈變薄，偶見腸腔有氣體；盲腸直腸0級病變，眼觀無病變。由此可見，腹腔注射的ETEC K88主要侵襲腸道近端，空腸病變最嚴重，為此本試驗進一步對腹瀉小鼠(空白對照組為正常小鼠)空腸進行HE染色處理，進一步觀察其形態(tài)和病理變化。

2.2.4 TB對小鼠空腸組織形態(tài)的影響

由圖1可見，各組小鼠空腸損傷程度差別明顯，就腸道組織完整性來看，損傷程度由大到小的順序：陰性對照組>試驗1組>陽性對照組>試驗2組>空白對照組>試驗4組>試驗3組。與空白對照組相比，陰性對照組小鼠空腸黏膜損傷嚴重，腸絨毛斷裂，杯狀細胞、漿細胞大量浸潤。與陰性對照組相比，陽性對照組和試驗1、2組小鼠空腸黏膜組織較完整，腸絨毛邊緣不清晰，絨毛形態(tài)較完整，可見隱窩，上皮細胞排列松散；試驗3、4組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)清晰，絨毛邊緣清晰、完整、排列整齊，上皮細胞排列緊密。由此可見，飼糧中添加0.20%、0.30%TB可有效減輕ETEC K88對小鼠腸道的損傷。

A：空白對照組 blank control group；B：陰性對照組 negative control group；C：陽性對照組 positive control group；D：試驗1組 experimental group 1；E：試驗2組experimental group 2；F：試驗3組experimental group 3；G：試驗4組experimental group 4。

2.2.5 TB對小鼠血清炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響

由表5可知，與空白對照組相比，其他各組小鼠腹腔注射ETEC K88后血清CRP、ET含量與DAO活性均有不同程度增加，以陰性對照組增加幅度最大，分別增加了128.42%(P<0.05)、85.88%(P<0.05)和298.79%(P<0.01)，以試驗3組增加幅度最小，分別增加了65.47%(P>0.05)、5.65%(P>0.05)和101.61%(P<0.01)。與陰性對照組相比，其他各組小鼠血清CRP、ET含量和DAO活性均有不同程度降低，以試驗3組降低幅度最大，分別降低了27.56%(P>0.05)、43.16%(P<0.05)和49.44%(P<0.01)，其次為試驗4組，分別降低了23.62%(P>0.05)、39.67%(P<0.05)和46.40%(P<0.01)。與陽性對照組相比，試驗3、4組小鼠血清CRP、ET含量和DAO活性均有不同程度降低，但差異不顯著(P>0.05)。試驗1、2、3、4組間小鼠血清CRP、ET含量和DAO活性相近，以試驗3組最低，其次為試驗4組，試驗2組較高，試驗1組最高。試驗3組小鼠血清ET含量顯著低于試驗1組(P<0.05)，降低了39.19%。與空白對照組相比，試驗1、2、4組及陽性對照組和陰性對照組小鼠血清SIgA含量均有不同程度降低，分別降低了71.80%(P<0.01)、61.33%(P<0.05)、44.38%(P<0.05)、68.25%(P<0.05)、74.05%(P<0.01)，試驗3組只在數(shù)值上降低了30.19%，差異不顯著(P>0.05)。與陰性對照組相比，試驗3、4組小鼠血清SIgA含量顯著增加(P<0.05)，分別增加了169.00%、114.33%。與陽性對照組相比，試驗3、4組小鼠血清SIgA含量顯著增加(P<0.05)，分別增加了72.81%、37.69%。

表5 TB對小鼠血清炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響

3 討 論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加0.10%～0.15%的TB可替代抗生素等藥物添加劑，同時仔豬的生長性能、腸組織發(fā)育和免疫功能得到改善，添加0.20%～0.25%的TB不僅可替代抗生素等藥物添加劑，而且顯著提升仔豬的生長性能、養(yǎng)分消化率和健康水平，顯著增強腸組織功能[23]。本試驗主要研究TB對ETEC K88誘發(fā)的腸道損傷的緩解作用，為其在仔豬上的應(yīng)用提供借鑒。

本研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠飼喂添加不同水平TB的飼糧14 d后，腹腔注射ETEC K88懸液后小鼠腹瀉率和死亡率均明顯低于陰性對照組小鼠，其中添加0.10%TB的試驗2組與陽性對照組的腹瀉率和死亡率相當(dāng)，添加0.20%、0.30%TB的試驗2、3組的腹瀉率低于陽性對照組，表明飼糧中添加TB可有效緩解ETEC K88引起的小鼠腹瀉，且添加0.20%或0.30%TB時效果優(yōu)于添加0.16%金霉素。腹腔注射ETEC K88后小鼠的平均日增重減少17.24%，而飼喂TB小鼠的平均日增重均有不同程度增加，其中添加0.20%和0.30%TB時平均日增重顯著增加，效果與添加0.16%金霉素相當(dāng)。由此可見，飼糧添加TB可緩解ETEC K88對小鼠增重的負面影響，與Hou等[9]和Wang等[24]的研究結(jié)果一致。這可能與TB可有效改善小鼠的腸道消化吸收能力和健康狀態(tài)有關(guān)。

腸道黏膜不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場所，還是抵御外界病原體進入機體的屏障。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射的ETEC K88主要侵襲腸道近端，以空腸病變最嚴重，表現(xiàn)為腸絨毛斷裂，腸腺消失，杯狀細胞、漿細胞大量浸潤。飼糧中添加0.20%、0.30%TB可有效緩解ETEC K88誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠腸道損傷，保護腸組織結(jié)構(gòu)完整，使腸絨毛邊緣清晰、完整、排列整齊，隱窩清晰，腸腺明顯，上皮細胞排列緊密。這與前人研究結(jié)果[25-26]一致。飼糧添加TB可改善腸炎肉雞的腸道黏膜屏障功能，提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力[25-26]，而且TB可提高仔豬腸黏膜表皮生長因子受體(EGFR)基因的表達，通過激活EGFR信號緩解乙酸誘發(fā)的腸道損傷，使平均日增重提高13.81%[27]?？股乜山档湍c道中緊密連接蛋白的表達，以及與離子交換體、丁酸轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因和蛋白的表達，而飼糧添加TB可顯著減少這些損失[6]。

SIgA是由腸黏膜上皮細胞分泌的一種關(guān)鍵性抗炎抗體[28]。腸道黏膜分泌SIgA是保護腸道感染的主要防御機制之一，因此被用作細菌致病性的標(biāo)志指標(biāo)[29]。當(dāng)外界或內(nèi)部抗原刺激時，腸黏膜分泌SIgA和細胞因子等物質(zhì)維持腸上皮的穩(wěn)態(tài)[26]。DAO是一種存在于哺乳動物小腸黏膜和腸絨毛上皮細胞中催化二胺的細胞內(nèi)酶，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子平衡、促進細胞修復(fù)保護腸道黏膜。腸道黏膜屏障功能衰竭時或腸黏膜細胞壞死時血清DAO活性升高，因此DAO活性可反映腸道損傷狀態(tài)[27,30]。腸道屏障功能受損后ET轉(zhuǎn)移入血，造成血液中ET含量升高，研究表明動物大腸桿菌感染后血清ET含量升高明顯[31-32]。CRP是在機體受到感染或組織損傷時血漿中一些急劇上升的蛋白質(zhì)(急性蛋白)[33]，細菌感染時血清CRP的含量明顯升高至中等度，陽性率可達90%以上，而病毒等感染時，血清這個CRP含量多為正?；蜉p度升高，因此CRP含量常被用來鑒別診斷細菌感染與非細菌感染[34-35]。試驗小鼠腹腔注射ETEC K88后，血清SIgA含量顯著降低，DAO活性顯著增加，ET、CRP含量顯著升高，符合細菌感染腸道損傷后導(dǎo)致的炎癥相關(guān)指標(biāo)變化；且試驗結(jié)果表明飼糧添加金霉素和TB均可有效減緩這些變化，綜合比較發(fā)現(xiàn)飼糧添加0.20%或0.30% TB比添加0.16%金霉素的作用效果更明顯。由此可見，飼糧中添加0.20%或0.30%的TB可有效緩解由ETEC K88誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠腸道損傷，降低腸道的通透性，保護腸道黏膜。

4 結(jié) 論

① 腹腔注射4.9×107CFU/mL ETEC K88懸液0.5 mL可以成功構(gòu)建小鼠腹瀉模型。

② 在小鼠基礎(chǔ)飼糧中添加0.20%或0.30%的TB可緩解由ETEC K88誘導(dǎo)產(chǎn)生的腸道損傷，且效果優(yōu)于添加0.16%的金霉素。