幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物的定植過程及早期調(diào)控

李科南 杜海東 史彬林 娜仁花

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

反芻動(dòng)物可以將其他動(dòng)物難以利用的粗纖維降解為自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而為人類提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，如牛、羊等肉制品和奶制品。反芻動(dòng)物之所以具有獨(dú)特的利用各種飼料的能力，這主要?dú)w功于反芻動(dòng)物瘤胃中棲息著復(fù)雜、多樣、非致病的各種微生物，包括細(xì)菌、真菌、原蟲和古菌。這些微生物通過分泌不同種類的分解酶來降解飼料中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素并產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)，VFAs能夠提供反芻動(dòng)物所需要能量的70%以上。另外，瘤胃中的微生物還能合成B族維生素以及必需氨基酸供反芻動(dòng)物利用[1]。由于新生反芻動(dòng)物通過食管溝反射的方式將進(jìn)食的母乳直接送入到皺胃，以單胃動(dòng)物的消化方式進(jìn)行消化吸收，所以新生反芻動(dòng)物的瘤胃是不具備發(fā)酵功能的。新生反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵功能由未建立到完善的階段被稱作瘤胃發(fā)育過程，之前的研究已經(jīng)證明瘤胃發(fā)育過程分為3個(gè)階段：非反芻階段(0～3周齡)、過渡階段(3～8周齡)和反芻階段(8周齡以后)[2]。在新生反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)育過程中，各種微生物相繼在瘤胃中定植，復(fù)雜的微生物區(qū)系逐漸建立，從而使反芻動(dòng)物瘤胃具備發(fā)酵粗纖維的能力。然而，目前人們對(duì)于反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育過程中各種微生物的定植以及群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律知之甚少。此外，人們還希望在瘤胃微生物完全建立之前通過調(diào)控新生反芻動(dòng)物的飼糧結(jié)構(gòu)和飼養(yǎng)管理等，達(dá)到促進(jìn)瘤胃內(nèi)不同微生物群落的定植并產(chǎn)生持久影響的效果，進(jìn)而達(dá)到改善瘤胃發(fā)酵功能、減少甲烷排放和提高反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能的目的。

已有研究報(bào)道，成年反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[3-4]，一些調(diào)控措施對(duì)于成熟瘤胃中微生物群落的調(diào)控只能產(chǎn)生短暫的影響，一旦停止調(diào)控瘤胃微生物群落組成和發(fā)酵將會(huì)恢復(fù)到處理之前的狀態(tài)[5]。Yez-Ruiz等[5]認(rèn)為，瘤胃微生物群落完全建立之前，是瘤胃微生物群落早期調(diào)控的理想窗口期。Abecia等[6]報(bào)道，早期飼糧調(diào)控可以改變瘤胃中古菌菌群的定植，從而影響羔羊甲烷的排放。而深入了解早期瘤胃微生物的定植過程是科學(xué)精準(zhǔn)調(diào)控瘤胃功能的基礎(chǔ)。因此，本研究首先綜述了新生反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育過程中各種微生物的定植過程，然后報(bào)道了幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物早期調(diào)控的最新研究成果，以期為反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育過程中早期調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 瘤胃微生物定植過程

1.1 細(xì)菌群落的建立過程

最早研究者認(rèn)為大部分剛出生的反芻動(dòng)物的胃腸道是無菌的，然后來自母體和周圍環(huán)境中的微生物在瘤胃中迅速定植[7]，一般在出生數(shù)分鐘內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量約為1.9×108拷貝數(shù)/g瘤胃內(nèi)容物[8]。Guzman等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在出生0～20 min的犢牛瘤胃中發(fā)現(xiàn)甲烷菌和纖維降解菌的存在，表明瘤胃微生物的定植可能在分娩之前或者分娩過程中就已經(jīng)發(fā)生。最新的研究通過使用多組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)動(dòng)物在出生前腸道中已經(jīng)定植了有活性的微生物組。研究人員以足月無菌剖宮產(chǎn)的羔羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，無菌采集羔羊的臍帶血和盲腸食糜樣品，檢測(cè)盲腸食糜中的微生物組與臍帶血和盲腸食糜中的微生物代謝產(chǎn)物后發(fā)現(xiàn)，胎兒腸道中存在低多樣性和低生物量的微生物組，以變形菌門、放線菌門和厚壁菌門的細(xì)菌組成為主，其中大腸桿菌是豐度最多的微生物。在盲腸食糜中檢測(cè)到了多種微生物代謝產(chǎn)物，確定了這些微生物具有代謝活性。但是遺憾的是該研究并沒有報(bào)道胎兒瘤胃中是否存在微生物組[10]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，在反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)育過程中微生物以一種明確的、漸進(jìn)的順序迅速進(jìn)行定植。微生物定植順序及豐度主要取決于相同功能微生物對(duì)可利用底物的競(jìng)爭(zhēng)，即瘤胃“生態(tài)位搶占”。生命早期微生物群落由需氧和兼性厭氧微生物組成，在6～8周齡時(shí)被厭氧類群完全取代[11]。Rey等[12]在研究新生犢牛瘤胃微生物的定植過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，瘤胃中細(xì)菌的定植呈現(xiàn)三步變化：出生后2 d，變形菌門(70%)和擬桿菌門(14%)為優(yōu)勢(shì)菌門，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)(58%)為優(yōu)勢(shì)菌科；出生后3～12 d，擬桿菌屬(Bacteroides)(21%)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)(11%)、梭桿菌屬(Fusobacterium)(5%)和鏈球菌屬(Streptococcus)(4%)為優(yōu)勢(shì)菌屬，此階段便已有成熟瘤胃中常見的細(xì)菌存在，說明參與降解飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的菌群在反芻動(dòng)物攝取固體飼料之前便已在瘤胃中定植；出生后15～83 d，隨著固體飼料攝入量的迅速增加，普雷沃氏菌屬成為最優(yōu)勢(shì)菌屬(42%)，其具有降解蛋白質(zhì)和利用淀粉的重要功能[13]，這說明此階段飼糧對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)變化的影響最顯著。焦金真[14]通過MiSeq高通量測(cè)序研究了0～70日齡山羊瘤胃食糜細(xì)菌定植規(guī)律發(fā)現(xiàn)，變形菌門相對(duì)豐度隨日齡增長(zhǎng)而降低，而擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度的變化與變形菌門正好相反，許多研究結(jié)果[3,12,15]與此一致。在屬水平，剛出生羔羊瘤胃內(nèi)容物中優(yōu)勢(shì)菌屬為埃希氏菌屬(Escherichia)、弓形桿菌屬(Arcobacter)和卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)。埃希氏菌屬為兼性厭氧菌，可改變瘤胃內(nèi)環(huán)境為厭氧微生物提供適宜定植環(huán)境；7日齡后，埃希氏菌屬比例顯著降低，而擬桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬；28日齡后，普雷沃氏菌屬為最優(yōu)勢(shì)菌屬(>20%)，而纖維降解菌在開食料供給后才可以檢測(cè)到[16]。李碧波[17]認(rèn)為羔羊0～14日齡和28～56日齡瘤胃菌群差異最明顯，可能與0～14日齡以母乳為主，28～56日齡逐漸采食固體飼料有關(guān)。瘤胃微生物的定植可以分為三大類，分別是先導(dǎo)菌、過渡菌和成熟菌。芽孢桿菌屬(Bacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)為主要的先導(dǎo)菌，擬桿菌屬、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、NK4A214和密螺旋體菌屬2(Treponema2)等為主要的過渡菌，成熟菌為普雷沃氏菌屬1和理巖菌科RC9。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律，羔羊0～14日齡是微生物發(fā)育階段，14～28日齡是微生物過渡階段，28～56日齡是微生物穩(wěn)定階段[15]；該研究還發(fā)現(xiàn)，羔羊0日齡時(shí)，厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，占比為80%，而擬桿菌門占比為8%；0日齡之后，擬桿菌門所占比例迅速上升，達(dá)50%，并隨日齡增長(zhǎng)基本保持穩(wěn)定狀態(tài)。在屬水平上，羔羊剛出生沒哺乳之前優(yōu)勢(shì)菌屬是芽孢桿菌、乳球菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)，特別是芽孢桿菌屬，其比例高達(dá)55.55%；攝入母乳后，擬桿菌門變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌門，芽孢桿菌屬和乳球菌屬的數(shù)量逐漸減少，最后幾乎消失。芽孢桿菌屬和乳球菌屬作為母體陰道原生菌群主要組成部分會(huì)傳遞給下一代，并在形成機(jī)體的定植抗性和調(diào)節(jié)宿主的免疫效應(yīng)方面起到關(guān)鍵作用[18]。在過渡階段，卟啉單胞菌屬、梭菌屬、疣微菌科、Bibersteiniaren被認(rèn)為是過渡菌群，可能與哺乳有關(guān)，21日齡后隨著纖維的攝入而逐漸減少。另外，理巖菌科RC9腸道群、普雷沃氏菌科UCG-003、擬桿菌目_S24-7、普雷沃氏菌屬1、瘤胃球菌屬1、瘤胃球菌屬2、月形單孢菌屬1、纖維桿菌屬的比例從28日齡開始增加，這些菌群與纖維的降解有關(guān)，出生28 d后瘤胃菌群逐漸穩(wěn)定。

除了定植在瘤胃內(nèi)容物的細(xì)菌，定植在瘤胃上皮(指瘤胃乳頭和黏膜)的細(xì)菌也日益引發(fā)了研究者們的關(guān)注。許多研究發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮定植的細(xì)菌多樣性和豐富度差異顯著[19-23]，這是由于動(dòng)物采食固體飼料后，食糜聚集在瘤胃腹囊，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮之間的微環(huán)境(如氧氣、pH)和細(xì)菌組成不同。與瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌相比，瘤胃上皮細(xì)菌可能與氮利用、氧清除、上皮細(xì)胞增殖和負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)瘤胃壁吸收VFAs的基因表達(dá)有關(guān)，而與發(fā)酵碳水化合物無關(guān)[23]。李碧波[17]研究發(fā)現(xiàn)，隨著山羊日齡的增長(zhǎng)，瘤胃上皮中的變形菌門被厚壁菌門和擬桿菌門所取代，此外，隨著山羊日齡的增長(zhǎng)，丁酸弧菌屬2(Butyrivibrio2)成為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。丁酸弧菌屬2作為瘤胃上皮產(chǎn)丁酸的主要菌屬，產(chǎn)生的丁酸被瘤胃上皮直接吸收，提高了瘤胃上皮對(duì)丁酸的利用率，并有利于瘤胃上皮細(xì)胞的增殖和發(fā)育[24]。焦金真[14]發(fā)現(xiàn)，山羊瘤胃上皮定植的細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)隨日齡增長(zhǎng)而增加，且主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果表明不同日齡時(shí)細(xì)菌組成不同。在門水平，優(yōu)勢(shì)菌門由變形菌門轉(zhuǎn)為厚壁菌門和擬桿菌門，這與李碧波[17]的研究結(jié)果一致；在屬水平，0日齡時(shí)埃希氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，固體開食料供給后普雷沃氏菌屬、丁酸弧菌屬、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)隨日齡增長(zhǎng)而增加，并成為優(yōu)勢(shì)菌屬[14]。Chai等[19]也發(fā)現(xiàn)山羊羔羊瘤胃上皮細(xì)菌以彎曲桿菌屬為主，并且彎曲桿菌屬可能參與瘤胃解剖形態(tài)發(fā)育以及氨和VFAs的代謝。

以上研究表明，由于宿主、飼糧成分、飼養(yǎng)管理和個(gè)體差異等因素的影響，早期瘤胃微生物群落建立的具體時(shí)間及其定植規(guī)律不盡相同。雖然日齡變化會(huì)對(duì)瘤胃微生物定植產(chǎn)生影響，但主要的影響因素還是飼糧的變化。根據(jù)上述研究結(jié)果，早期瘤胃微生物建立過程大致可劃分為3個(gè)階段：1)最初定植階段(出生后0～2 d)，微生物主要來源于母體(包括產(chǎn)道、初乳和唾液)、外界環(huán)境等[25]，如芽孢桿菌和乳球菌屬。2)過渡階段(出生后3～28 d)，由初乳過渡到常乳，可利用乳中營(yíng)養(yǎng)成分(單糖、乳糖或乳脂等)的菌群比例逐漸升高，如擬桿菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)等[26-27]，這些菌屬降解簡(jiǎn)單碳水化合物產(chǎn)生的乙酸可被丁酸球菌屬(Butyricicoccus)和糞桿菌屬(Faecalibacterium)等利用產(chǎn)生丁酸，丁酸可以促進(jìn)瘤胃上皮的發(fā)育[28]。因此，丁酸球菌屬和糞桿菌屬的比例與母乳攝入量呈正相關(guān)。另外，此階段已定植細(xì)菌也是成熟瘤胃中常見的組成成員，如普雷沃氏菌屬和擬桿菌屬。3)成熟階段(固體飼料攝入增加)，隨著母乳攝入比例減少，固體的開食料和粗纖維的采食量逐漸增加，可降解淀粉和纖維等微生物的比例逐漸升高，并成為瘤胃中的穩(wěn)定菌屬。如普雷沃氏菌屬1、瘤胃球菌科UCG-005、理巖菌科RC9和瘤胃球菌科UCG-010等[17,29]。

1.2 產(chǎn)甲烷菌群落的建立過程

產(chǎn)甲烷菌占瘤胃微生物群落的0.3%～3.0%[30]，在產(chǎn)甲烷菌當(dāng)中，大約78%的產(chǎn)甲烷菌是氫營(yíng)養(yǎng)型的，而22%的產(chǎn)甲烷菌可以利用來自甲醇或甲胺的甲基基團(tuán)合成甲烷，而利用乙酸合成甲烷的產(chǎn)甲烷菌很少[31]。Henderson等[32]對(duì)來自全球35個(gè)國(guó)家的瘤胃和前腸樣品(來自379頭牛、106只綿羊、59只鹿、52只山羊和72個(gè)其他類型反芻動(dòng)物)的產(chǎn)甲烷菌群落組成進(jìn)行了全面地普查，結(jié)果顯示，盡管樣本來自不同的反芻動(dòng)物、地點(diǎn)、飼糧和條件，但優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌屬卻驚人的相似，幾乎所有的反芻動(dòng)物瘤胃樣品中都發(fā)現(xiàn)了Methanobrevibactergottschalkii和Mbb.Ruminantium，平均占到古菌群落的74%，連同Methanosphaerasp.和2個(gè)Methanomassiliicoccaceae的附屬群，5個(gè)主要產(chǎn)甲烷菌群幾乎占到古菌群落的90%。反芻動(dòng)物排放甲烷不僅會(huì)加劇全球溫室效應(yīng)，而且還會(huì)造成2%～12%的飼糧能量浪費(fèi)。因此，反芻動(dòng)物胃腸道甲烷減排對(duì)緩解全球溫室效應(yīng)和提高飼養(yǎng)效率具有重要意義。最近的研究側(cè)重于通過在反芻動(dòng)物生命早期對(duì)微生物群落進(jìn)行調(diào)控來減少甲烷的形成，正如Yez-Ruiz等[5]所總結(jié)的新生反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落更具可塑性，因?yàn)榕c成年反芻動(dòng)物已建立的微生物組相比，對(duì)其進(jìn)行調(diào)控更有可能產(chǎn)生持久的影響。而了解產(chǎn)甲烷菌在瘤胃發(fā)育過程中的定植規(guī)律，為不同發(fā)育時(shí)期的精準(zhǔn)調(diào)控和確定最佳調(diào)控窗口期提供了可能，但是目前有關(guān)產(chǎn)甲烷菌在早期瘤胃發(fā)育過程中定植的研究較少。

剛出生的反芻動(dòng)物瘤胃中就有產(chǎn)甲烷菌定植，并且產(chǎn)甲烷菌群的建立和發(fā)展是一個(gè)迅速的過程。較早的研究報(bào)道，產(chǎn)甲烷菌在2～4日齡的羔羊瘤胃中就已經(jīng)存在，并且在10～14日齡羔羊瘤胃中產(chǎn)甲烷菌豐度便已達(dá)到成年羊瘤胃中的水平[33]。隨著分子生物相關(guān)研究技術(shù)的發(fā)展，Guzman等[9]基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，在出生后20 min的犢牛瘤胃中就檢測(cè)到有代謝活性的產(chǎn)甲烷菌，如Methanomicrobialesmobile、Methanoccocalesvotae和Methanobrevibacterspp.。有報(bào)道稱，山羊瘤胃細(xì)菌的組成隨著年齡的改變而發(fā)生明顯的變化，然而，類似的年齡依賴模式在山羊瘤胃古菌中并不明顯。一項(xiàng)有關(guān)山羊1日齡到2歲齡的12個(gè)年齡段的研究發(fā)現(xiàn)，山羊各年齡段瘤胃液中優(yōu)勢(shì)菌門均為廣古菌門(84.02%)和泉古菌門(14.38%)，1～15日齡廣古菌門的豐度逐漸增加，之后豐度趨于穩(wěn)定，而泉古菌門的豐度從出生到15日齡逐漸降低，之后也趨于穩(wěn)定；不同年齡段個(gè)體古菌菌群組成在5月齡之前差異較大，5月齡之后差異逐漸減小，并趨于穩(wěn)定；而不同年齡段個(gè)體的細(xì)菌菌群在1.5歲后逐漸穩(wěn)定[34]。也有研究認(rèn)為日齡是影響反芻動(dòng)物瘤胃中產(chǎn)甲烷菌定植的重要因素之一。焦金真[14]通過MiSeq高通量測(cè)序研究了補(bǔ)飼和放牧條件下0、7、28、42和70日齡山羊瘤胃食糜中產(chǎn)甲烷菌的定植規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論哪種飼養(yǎng)方式，從7～70日齡，操作分類單元(OTU)個(gè)數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均隨日齡的增長(zhǎng)而呈二次增加；產(chǎn)甲烷菌在出生后1周內(nèi)開始定植，無論是哪個(gè)日齡，產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢(shì)屬主要是Methanobrevibacter、Methanosphaera和Rumen cluster C。在7日齡時(shí)，Methanobrevibacter和Methanosphaera比例很低，大部分為未鑒定的產(chǎn)甲烷菌(77.8%)；在開食料供給后，Methanobrevibacter、Methanosphaera和Rumen cluster C的相對(duì)豐度均急劇升高，表明開食料對(duì)于產(chǎn)甲烷菌的組成有很大的影響。在Methanobrevibacter中，Methanobrevibactergottschalkii相對(duì)豐度最高，其次是Methanobrevibacterruminantium，而Methanobrevibacter中其他的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)化枝相對(duì)豐度較低。同瘤胃細(xì)菌研究類似，產(chǎn)甲烷菌的研究大部分也都局限于瘤胃固相、液相和原蟲，考慮到定植于瘤胃上皮的微生物與瘤胃發(fā)育以及免疫功能之間可能存在緊密聯(lián)系，因此對(duì)分布于瘤胃不同部位產(chǎn)甲烷菌的研究具有積極意義。Wang等[35]利用qRT-PCR技術(shù)研究了出生1、10、20、38、41、50、60 d的山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌在瘤胃固相、液相、上皮、原蟲表面定植過程，發(fā)現(xiàn)在1日齡時(shí)瘤胃液相與上皮中就有代謝活性的產(chǎn)甲烷菌定植，4個(gè)部分中產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù)前期隨著日齡的增加而增加，而補(bǔ)飼之后4個(gè)部分中產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù)均趨于穩(wěn)定。瘤胃固相中產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)是最多的，而瘤胃上皮中產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)最少?；谔崛NA的16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果顯示：Methanobrevibacter、CandidatusMethanomethylophilus以及Methanosphaera是4個(gè)部分中豐度最高的產(chǎn)甲烷菌，這3個(gè)產(chǎn)甲烷菌屬的相對(duì)豐度總共占據(jù)了總產(chǎn)甲烷菌的89.8%～98.3%。

1.3 真菌群落的建立過程

眾所周知，和瘤胃細(xì)菌菌群一樣，厭氧真菌在降解纖維性飼料原料中發(fā)揮著重要作用，因?yàn)樗鼈兡軌蚱茐闹参锝M織結(jié)構(gòu)并促進(jìn)纖維分解菌對(duì)纖維顆粒的定植。瘤胃中的真菌在分解飼糧纖維過程中還會(huì)釋放大量有利于產(chǎn)甲烷菌群落的氫氣(H2)。因此，厭氧真菌活性可能會(huì)影響成熟瘤胃中細(xì)菌和古菌群落的結(jié)構(gòu)，從而影響纖維利用效率和甲烷排放量[36]。以前的研究認(rèn)為瘤胃真核生物定植與原核生物相比較晚，羔羊8～10日齡后瘤胃才出現(xiàn)真菌定植[37]。但是張科[38]采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)0、3、7、14、21、42、56日齡羔羊瘤胃真菌的定植過程進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0日齡的羔羊瘤胃中便已有真菌定植，說明真菌在固體飼料攝入之前就已在瘤胃中定植。0日齡真菌群落與其他日齡差異較大，3、7、14、21日齡時(shí)真菌群落結(jié)構(gòu)差異不大，28、42、56日齡時(shí)真菌群落結(jié)構(gòu)差異不大。14日齡之前，子囊菌門(Ascomycota)所占比例較高，為優(yōu)勢(shì)菌門，14日齡之后，新美鞭菌門(Neocallimastigomycota)所占比例逐漸增加，成為優(yōu)勢(shì)菌門。屬水平分析顯示，0日齡的羔羊曲霉屬真菌(Aspergillus)所占比例最高，為47%，3日齡后逐漸減少，到14日齡時(shí)消失。焦金真[14]也發(fā)現(xiàn)類似的規(guī)律，山羊瘤胃真菌定植較早，在出生當(dāng)天就已定植，在門水平上，瘤胃真菌主要由子囊菌門和新美鞭菌門組成，子囊菌門在0和7日齡時(shí)豐度較高，而新美鞭菌門在28、42和70日齡時(shí)豐度較高。

1.4 原蟲類群的建立過程

原蟲即原生動(dòng)物，分屬于鞭毛蟲(flagellates)和纖毛蟲(ciliates)，鞭毛蟲多存在于新生反芻動(dòng)物瘤胃，隨日齡增加，鞭毛蟲數(shù)量逐漸減少，成年后瘤胃中原蟲類群以纖毛蟲為主。盡管瘤胃原蟲數(shù)量相對(duì)于細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌少，但其細(xì)胞體積大，因此其生物量可占瘤胃內(nèi)微生物總量約20%或達(dá)到50%。與厭氧真菌一樣，原蟲與瘤胃古菌和細(xì)菌群落密切相關(guān)，可以影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、發(fā)酵和甲烷產(chǎn)量[39]。然而，與其他瘤胃微生物不同的是，新生反芻動(dòng)物纖毛原蟲的建立依賴于成年動(dòng)物唾液直接或間接的接觸[40]。原蟲建立時(shí)間一般較其他微生物群落晚，一般出生2周內(nèi)瘤胃可發(fā)現(xiàn)原蟲的存在[41]，并且通常是較小的Entodinia類原蟲，Entodinia類原蟲會(huì)在較大的Endomorphs和Holotrich原蟲之前定植。但是，如果新生動(dòng)物在出生后就與其他反芻動(dòng)物隔離，則其瘤胃內(nèi)將無法定植原蟲[42]。

2 幼齡反芻動(dòng)物微生物群落的調(diào)控

幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落具有很強(qiáng)的可塑性。在此期間，任何外部干預(yù)都可能導(dǎo)致瘤胃微生物群落短期或長(zhǎng)期性的變化。在瘤胃微生物定植早期階段進(jìn)行調(diào)控，可以引導(dǎo)瘤胃微生物菌群有序的定植和健康的發(fā)酵，提高宿主的健康水平和后續(xù)生長(zhǎng)性能。而飼糧作為瘤胃微生物發(fā)酵的底物，其營(yíng)養(yǎng)組成和物理特性直接影響微生物的定植。Yez-Ruiz等[43]發(fā)現(xiàn)羔羊在斷奶前后飼喂精料或粗飼料可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物結(jié)構(gòu)，并且此影響可持續(xù)超過4個(gè)月。Dias等[27]采用新一代測(cè)序技術(shù)研究了添加開食料對(duì)斷奶前45頭犢牛瘤胃古菌、細(xì)菌和厭氧真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)飼開食料后增加了瘤胃中降解碳水化合物細(xì)菌群落(如Megasphaera、Sharpea和Succinivribrio)的多樣性，瘤胃細(xì)菌群落的變化也與瘤胃發(fā)酵模式的變化相關(guān)，而瘤胃發(fā)酵模式的轉(zhuǎn)變促進(jìn)了Methanosphaerasp. A4的定植。相比之下，飼喂牛乳的犢牛瘤胃中降解乳中營(yíng)養(yǎng)成分的細(xì)菌群落為優(yōu)勢(shì)菌屬(如乳桿菌屬、擬桿菌屬和副擬桿菌屬)。在羔羊開食料中添加亞麻籽油，瘤胃中琥珀酸弧菌科和韋榮氏菌科的相對(duì)豐度較高，停止添加亞麻籽油后該作用效果仍有效[44]。這說明通過飼糧調(diào)控早期瘤胃微生物群落以達(dá)到調(diào)控成熟瘤胃微生物群落具有可行性。早期瘤胃微生物群落的調(diào)控措施除了飼糧類型外，還包括瘤胃微生物的移植和在飼糧中添加特異性促進(jìn)或抑制某些微生物的添加劑。瘤胃微生物移植是一種重塑瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的有效手段。給新生羔羊持續(xù)灌服成年羊新鮮瘤胃液11周，促進(jìn)了原蟲的定植，提高了粗飼料的采食量和瘤胃氨態(tài)氮(NH3-N)、VFAs濃度[45]。Yu等[46]給羔羊飼喂凍干的瘤胃液后發(fā)現(xiàn)改變了瘤胃反芻獸新月單胞菌(Selemonasruminantium)和埃氏巨球菌(Megasphaeraelsdenii)的組成,并降低了黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)的相對(duì)豐度。研究發(fā)現(xiàn)，天然植物提取物茶皂素[47]、桑葉黃酮[48]、白藜蘆醇[49]等都具有改善瘤胃發(fā)酵和降低瘤胃甲烷生成的作用。以白藜蘆醇為例，可降低羔羊瘤胃液中甲烷短桿菌的豐度，提高脫硫弧菌屬和普雷沃氏菌屬的豐度[50]，但停止添加后對(duì)瘤胃微生物群落是否具有長(zhǎng)期影響并沒有報(bào)道。此外，反芻動(dòng)物斷奶前后添加微生態(tài)制劑也可以改變瘤胃微生物的定植過程。例如，在1～9周齡羔羊的飼糧中添加芽孢桿菌屬，提高了瘤胃中瘤胃球菌科、RC9、普雷沃氏菌科和毛螺旋菌科等的相對(duì)豐度，并提高了瘤胃中的乙丙比[51]。1～180日齡的羔羊在飼糧中添加釀酒酵母，可促進(jìn)瘤胃中纖維降解菌的定植，降低瘤胃氨濃度，提高瘤胃VFAs濃度[52]。也有研究認(rèn)為通過使用特異性抑制劑抑制早期瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的定植，可能是減少成年反芻家畜甲烷排放的有效方法。Abecia等[53]研究表明，用甲烷抑制劑(溴氯甲烷)對(duì)母羊和初生羔羊進(jìn)行處理，當(dāng)停止處理3個(gè)月后仍然發(fā)現(xiàn)羔羊甲烷排放量減少約33%。

調(diào)控早期瘤胃微生物定植的文章相對(duì)較多，但是早期瘤胃微生物調(diào)控措施對(duì)成年反芻動(dòng)物是否有長(zhǎng)期影響效果，仍需進(jìn)一步確認(rèn)。除了上述調(diào)控措施外，掌握早期階段調(diào)控的最佳窗口期也非常關(guān)鍵。本綜述結(jié)合產(chǎn)甲烷菌、細(xì)菌和真菌群落的定植規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在固體飼料進(jìn)食之前這些微生物群落就已經(jīng)在瘤胃中定植，因此認(rèn)為早期微生物群落調(diào)控的“黃金窗口期”是在動(dòng)物剛出生后，這與Dias等[27]的觀點(diǎn)一致。

3 小 結(jié)

總而言之，由于瘤胃中的微生物種類繁多、關(guān)系復(fù)雜，導(dǎo)致反芻動(dòng)物早期瘤胃微生物群落建立過程復(fù)雜多變，仍需大量的試驗(yàn)來深入、精準(zhǔn)地研究早期瘤胃微生物群落的建立過程，以及早期瘤胃微生物群落建立過程中的功能、核心群落的相互作用機(jī)制和代謝途徑，這是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控的基礎(chǔ)。雖然日齡變化會(huì)對(duì)瘤胃微生物定植有影響，但主要的影響因素是飼糧的變化。目前的研究發(fā)現(xiàn)早期干預(yù)對(duì)調(diào)控瘤胃微生物定植具有較大潛力，但應(yīng)進(jìn)一步深入探討不同調(diào)控措施對(duì)幼齡反芻動(dòng)物的長(zhǎng)期影響效果，開發(fā)提高粗飼料利用、降低瘤胃甲烷生成的早期調(diào)控措施。