丁酸梭菌對腸道屏障的影響機制及其在畜禽養(yǎng)殖中應用的研究進展

王宗偉 付建中 李洪濤 李艷青

(1.濰坊科技學院，生物研發(fā)中心，濰坊 262700；2.壽光市行政審批服務(wù)局，壽光 262705；3.壽光市稻田鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，壽光 262706；4.臨沂布恩生物科技有限公司，臨沂 276036)

我國已經(jīng)禁止在全價配合飼料中使用抗生素類生長促進劑[1]，這將對畜禽的生長性能和健康產(chǎn)生負面影響。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有修復腸道黏膜、增強免疫和抗氧化性能以及預防疾病等多種抗病和促進腸道健康的作用，是理想的飼料用抗生素替代品。本文綜述了丁酸梭菌對腸道屏障的影響機制及其在生物安全性、畜禽抗病和促進腸道健康等畜禽養(yǎng)殖中應用的研究進展，以期為丁酸梭菌發(fā)揮替抗作用提供參考。

1 丁酸梭菌的發(fā)酵特性

丁酸梭菌又名酪酸梭菌，為革蘭氏陽性菌，厭氧，周身鞭毛，能運動。丁酸梭菌(芽孢)能夠耐受飼料制粒過程中的高溫高壓，對酸性胃液也有較好的耐受性，在過胃后pH大于5的腸道環(huán)境中才開始生長[2-3]。丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸(丁酸、乳酸和乙酸等)、消化酶(非淀粉多糖酶、脂肪酶和蛋白酶等)、抗菌肽、B族維生素和氫氣(H2)等[4-5]；個別菌種兼性好氧，且發(fā)酵產(chǎn)生E型肉毒毒素[6]。丁酸梭菌發(fā)酵時存在酸脅迫效應，工業(yè)化生產(chǎn)條件要求高，產(chǎn)量相對枯草芽孢桿菌等其他菌種要低。

2 丁酸梭菌對腸道屏障的影響機制

腸道屏障是指腸道防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)透過腸黏膜吸收進入畜禽體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能的總和[7]，根據(jù)功能的不同分為機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障。丁酸梭菌對腸道屏障的影響機制主要是保護畜禽(尤其是幼年和腸道功能不全畜禽)胃腸道免受外源性(細菌、病毒等)刺激，提高抵抗力，促進其生長。

2.1 對腸道機械屏障的影響

腸道機械屏障是畜禽腸道最重要的物理屏障，主要包括完整的腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接以及腸道的運動功能等。丁酸梭菌對腸道機械屏障的影響表現(xiàn)在以下3個方面：1)丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸等短鏈脂肪酸直接為腸上皮細胞提供能量，促進腸絨毛生長，增強腸道消化吸收功能[8]；2)發(fā)酵所產(chǎn)丁酸等通過提高腸上皮細胞的能量狀態(tài)，激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target protein of rapamycin，mTOR)信號通路介導的蛋白合成機制，上調(diào)緊密連接蛋白——密封蛋白(claudin)、閉合蛋白(occludin)和閉鎖小帶蛋白(zonula occlaudin，ZO)的表達，降低腸道通透性，維持腸道上皮屏障的完整性[9-11]；3)丁酸梭菌通過上調(diào)腸道肌層結(jié)締組織中卡哈爾間質(zhì)細胞膜表面Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)的表達，促進腸道蠕動[12]，這有助于避免腸道內(nèi)細菌的長時間黏附和促進菌群的更新。

2.2 對腸道化學屏障的影響

腸道的化學屏障主要包括覆蓋在腸上皮表面起保護和潤滑作用以黏蛋白(mucin，MUC)為主的黏液、消化液、膽汁以及腸道微生物產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)等。丁酸梭菌通過黏附人結(jié)腸癌細胞(HT-29細胞)表面MUC的黏液多糖位點，增加MUC的產(chǎn)生和糖基化[13]；丁酸梭菌還顯著上調(diào)斷奶仔豬小腸MUC1、MUC4和MUC20的表達[14]。丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸等短鏈脂肪酸和CBP22等抗菌肽，能夠抑制有害菌的生長[5,15-17]。丁酸梭菌能顯著提高肉雞十二指腸淀粉酶和胰蛋白酶活性[4]以及肉鵝空腸脂肪酶活性[18]，改變蛋雞回腸膽汁酸組成[19]，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，但這些消化酶活性的提高和膽汁酸組成的改變是否具有增強腸道化學屏障的功能有待進一步研究。

2.3 對腸道免疫屏障的影響

腸道免疫屏障主要由樹突狀細胞等淋巴細胞、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)等抗菌物質(zhì)，以及派伊爾結(jié)腸相關(guān)淋巴組織等組成。丁酸梭菌及其調(diào)節(jié)后產(chǎn)生的腸道有益菌通過脂磷壁酸、DNA等菌體成分激活腸道免疫和抗氧化功能，通過其代謝產(chǎn)物(如丁酸、抗菌肽和其他短鏈脂肪酸等)發(fā)揮腸道抗菌和消炎等作用。

2.3.1 激活免疫系統(tǒng)

丁酸梭菌及代謝產(chǎn)物通過激活腸道細胞Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPR)等，在不誘導腸道細胞凋亡和壞死[20]的前提下，激活多個信號通路，增強腸道黏膜的天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。首先，丁酸梭菌能利用脂磷壁酸等菌體成份激活腸道細胞TLR2(配體為脂磷壁酸等)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)或獨立于MyD88的途徑——核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路，低水平上調(diào)促炎因子——白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達，激活腸道天然免疫系統(tǒng)，幫助機體清除病原體[9,21]。其次，丁酸等能激活短鏈脂肪酸受體(GPR43、GPR109a)，增加小鼠炎癥早期結(jié)腸黏膜固有層中性粒細胞、輔助性T淋巴細胞1和輔助性T淋巴細胞17的數(shù)量[22]。再次，丁酸梭菌能顯著上調(diào)仔豬空腸上皮細胞內(nèi)促進炎癥發(fā)展的炎癥小體——核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing protein，NLRP)3和抑制炎癥發(fā)展的NLRP6的表達，極顯著上調(diào)抑制炎癥發(fā)展的NLRP12的表達[23]。最后，丁酸梭菌能顯著提高肉雞腸道黏膜固有層B淋巴細胞分泌的sIgA的含量，增強機體免疫功能[24]。

2.3.2 降低炎癥反應

丁酸梭菌及代謝產(chǎn)物能通過腸道上皮細胞、樹突狀細胞等細胞膜表面受體TLR、GPR，以及細胞內(nèi)NLRP等，激活或抑制多個信號通路，調(diào)節(jié)細胞因子和免疫細胞，發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用。TLR：1)丁酸梭菌通過脂磷壁酸等激活TLR2、TLR5信號通路，上調(diào)腸道細胞中β-防御素、抗菌肽以及抗炎因子——轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2、TGF-β4等的表達[9,25]，緩解腸道炎癥。其中，丁酸梭菌與金葡菌脂磷壁酸間的差異以及白細胞介素-10(IL-10)的表達，在丁酸梭菌介導的免疫保護中發(fā)揮重要作用[26-27]。丁酸梭菌通過激活TLR2-細胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)-激活蛋白-1(activated protein-1，AP-1)激酶通路誘導腸道固有層樹突狀細胞分泌TGF-β1，促進腸內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的生成，抑制炎癥反應[28]。2)丁酸能顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子pu1與TLR4(配體為脂多糖等)基因啟動子區(qū)域的結(jié)合親和力[29]。丁酸梭菌通過抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號通路，降低沙門氏菌感染無特定病原(SPF)雞腸上皮細胞中促炎因子——干擾素-γ(IFN-γ)、IL-1β、IL-8和TNF-α的水平，緩解炎癥反應[30]。GPR：1)丁酸等短鏈脂肪酸通過腸道CD4+T細胞和先天性淋巴樣細胞膜上GPR41，抑制組蛋白去乙?；?，提高白細胞介素-22(IL-22)(IL-10家族)的含量，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[31]；2)丁酸通過上調(diào)小腸隱窩底部潘氏(Paneth)細胞GPR41、GPR43和GPR109amRNA的表達，分泌α-防御素，殺死鼠傷寒沙門氏菌[32]。NLRP炎癥小體：丁酸梭菌能下調(diào)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌仔豬腸道細胞中NLRP3和半胱天冬酶-1(Caspase-1)的表達，降低產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88感染斷奶仔豬血清和腸道IL-1β和白細胞介素-18(IL-18)的水平[33]。此外，丁酸梭菌通過降低炎癥小鼠腸道黏膜固有層樹突狀細胞數(shù)量，下調(diào)其膜表面T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM3)的表達，減少IL-1β、IL-6的產(chǎn)生[34]。丁酸梭菌所產(chǎn)丁酸還通過上調(diào)小鼠胃黏膜細胞凋亡抑制因子——B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)/細胞凋亡促進因子——Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)的表達比例，保護胃黏膜細胞[35]。

2.3.3 提高抗氧化性能

丁酸梭菌通過黏附在豬腸上皮細胞上，激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1，Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路，提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表達，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)和脂質(zhì)代謝物的水平，從而減少大腸桿菌對腸黏膜的損傷[36]；丁酸梭菌還通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)/Nrf2信號通路，上調(diào)SOD等抗氧化酶基因的表達，緩解豬霍亂沙門氏菌造成的豬上皮細胞氧化損傷[37]。丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)生的H2能迅速擴散到組織和細胞中，選擇性地與細胞內(nèi)的羥基自由基和亞硝酸陰離子等強氧化劑發(fā)生反應，并調(diào)節(jié)基因表達來降低氧化應激，發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用[38]。

2.4 對腸道生物屏障的影響

腸道的生物屏障主要包括益生菌在腸黏膜上皮定植形成的菌膜屏障，腸道內(nèi)的菌群與機體形成的相互依賴、相互制約的微生態(tài)平衡系統(tǒng)。丁酸梭菌對腸道生物屏障的作用是指其定植于腸上皮細胞上形成的菌膜屏障、丁酸等短鏈脂肪酸對有害菌的抑制作用以及優(yōu)化腸道菌群組成帶來的有利影響。

丁酸梭菌通過黏附腸上皮細胞[13]，競爭性阻擋有害菌與腸上皮細胞結(jié)合，形成有效的菌膜屏障，以阻止傷寒桿菌等革蘭氏陰性菌黏附腸細胞進行繁殖和釋放內(nèi)毒素，以及阻止金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌誘導的NF-κB和ERK信號通路引起的細胞凋亡[15,39-40]；丁酸梭菌還直接下調(diào)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌黏附基因FaeG與腸毒素基因estA、estB的表達，降低產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對豬腸道上皮細胞的損傷作用[41]。丁酸梭菌優(yōu)化腸道菌群組成，提高厚壁菌門數(shù)量，降低擬桿菌門數(shù)量，使雙歧桿菌等產(chǎn)短鏈脂肪酸菌數(shù)量增加，致病菌數(shù)量減少[42-43]，甚至具有改善小鼠后代腸道菌群平衡的作用[44]。丁酸梭菌所產(chǎn)丁酸等短鏈脂肪酸能夠降低腸道內(nèi)局部pH，抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌的生長、代謝以及毒素的產(chǎn)生[5,15-16]；產(chǎn)生的CBP22等抗菌肽對大腸埃希氏菌等也有抑制作用[5,17]。丁酸梭菌通過優(yōu)化腸道菌群提高丁酸和油酸的含量激活結(jié)腸上皮細胞GPR120，催化15-脂氧合酶將油酸等轉(zhuǎn)化為保護素D1(protectin D1，PD1)，從而促進IL-10和TGF-β1的分泌，降低促炎因子的分泌[45-46]。

3 丁酸梭菌的生物安全性

生物安全性是丁酸梭菌作為飼料添加劑首要考慮的因素，已篩選的丁酸梭菌在耐藥性、耐藥基因是否向致病菌水平轉(zhuǎn)移以及丁酸梭菌產(chǎn)毒性能等生物安全性方面是安全的[47-49]。丁酸梭菌主要對氨基糖苷類抗生素耐藥，對其他類型抗生素耐藥性的研究結(jié)果不一[47-50]，這可能與不同來源丁酸梭菌含有不同的耐藥基因有關(guān)。丁酸梭菌CBM588對慶大霉素等3種氨基糖苷類抗生素耐藥，對其他7類7種抗菌藥均無耐藥性，并認為其耐藥性是由于該類藥物無法通過其細胞膜主動轉(zhuǎn)運至菌體發(fā)揮作用[47]；但有研究認為，丁酸梭菌rpsL基因使氨基糖苷類抗生素失活[48]，需采用基因敲除驗證其耐藥機制。丁酸梭菌耐藥基因型與表型之間具有較高的一致性[41]。范偉祥等[49]對24株雞源丁酸梭菌中8類24種耐藥基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)mefA等16種耐藥基因全部成陰性，而全部成陽性的sul2、flor、blaTEM3種耐藥基因已經(jīng)不同程度的存在于沙門氏菌、大腸桿菌等有害菌中。24株雞源丁酸梭菌、CBM588均不含有typeA、typeB、typeE、typeF肉毒毒素基因和alpha、beta、epsilon梭菌毒素基因[47,49]；人源丁酸梭菌不含有艱難梭菌毒素、非溶血性腸毒素、腸毒素等毒素基因[51]。Isa等[47]認為，產(chǎn)E型肉毒毒素丁酸梭菌較少存在于食物和土壤中，并且typeE肉毒毒素基因體外轉(zhuǎn)移率較低，因此CBM588通過基因轉(zhuǎn)移獲得產(chǎn)毒能力的幾率很??；但2019年我國發(fā)現(xiàn)首例由丁酸梭菌引起嬰兒E型肉毒毒素中毒[52]，并且肉毒毒素基因(typeA、typeB、typeF)質(zhì)粒能夠從肉毒梭狀芽孢桿菌水平轉(zhuǎn)移到丁酸梭菌[53]。將來這些毒素基因是否會水平轉(zhuǎn)移到作為飼料添加劑的丁酸梭菌菌體中需要進一步觀察研究。同時建議在飼糧配制中盡量避免將丁酸梭菌與有可能含有肉毒梭狀芽孢桿菌的動物源性飼料(例如肉骨粉)合用。

4 丁酸梭菌在畜禽養(yǎng)殖中的應用

丁酸梭菌通過提高畜禽胃腸道健康水平、增強免疫和抗氧化性能、調(diào)節(jié)抗病基因的表達、減少仔豬斷奶等應激和預防疾病等，發(fā)揮抗病和促進腸道健康的作用。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌有效添加量為2×107～2.7×109CFU/kg飼糧。歐盟動物飼料添加劑和產(chǎn)品研究小組(EFSA panel on additives and products or substances used in animal feed，F(xiàn)EEDAP)認為，丁酸梭菌FERM BP-2789添加到飼糧中的最小有效添加量為2.5×108CFU/kg[54]。

4.1 豬

Han等[8]在28～56日齡“杜×長×大”斷奶仔豬飼糧中分別添加2.5×108CFU/kg丁酸梭菌與抗生素(金霉素0.075 g/kg、吉他霉素0.055 g/kg和維吉霉素0.01 g/kg)，結(jié)果料重比無顯著差異；2.5×109CFU/kg丁酸梭菌能顯著提高結(jié)腸短鏈脂肪酸含量、干物質(zhì)等表觀利用率。Chen等[55]在飼糧中添加4×108CFU/kg丁酸梭菌，能顯著提高21～56日齡斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和空腸絨毛高度/隱窩深度值，降低低消化率組(低消化率vs.高消化率=玉米vs.膨化玉米)腹瀉率，促生長作用與抗生素組(恩拉霉素20 mg/kg、金霉素75 mg/kg)無顯著差異。Lan等[56]在低營養(yǎng)水平飼糧(代謝能16.12 vs. 16.74 MJ/kg；蛋白質(zhì)19% vs. 20%)中添加丁酸梭菌等益生菌復合物能更有效地提高28～70日齡“杜×長×大”斷奶仔豬的平均日增重，降低糞便氨態(tài)氮和硫化氫濃度。本項目研究在商品教槽保育料中添加1×109CFU/kg丁酸梭菌，能夠顯著降低仔豬(尤其5 kg以下弱仔豬)腹瀉率；在養(yǎng)殖場將1×107CFU/kg丁酸梭菌和抗菌肽(枯草芽孢桿菌發(fā)酵提純)聯(lián)合用于防治仔豬斷奶后1周腹瀉，效果較好。此外，飼糧中添加抗性麥芽糖糊精能夠提高腸道丁酸水平，緩解腸道炎癥[57]，這提示是否可將抗性麥芽糖糊精與丁酸梭菌聯(lián)合用于纖維含量較少的斷奶仔豬飼糧。

Cao等[58]在妊娠90 d至斷奶21 d“長×大”二元母豬飼糧中添加2×108CFU/kg丁酸梭菌，能改善母豬抗氧化性能，縮短仔豬產(chǎn)程，提高哺乳仔豬生長性能。本項目研究在商品母豬妊娠和哺乳料中均添加3×108CFU/kg丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)母豬便秘減少，這可能是因為丁酸梭菌能夠優(yōu)化腸道菌群，促進非淀粉多糖消化，增加腸道蠕動，從而加速糞便排出體外。

4.2 雞

Zhang等[59]在飼糧中添加2×107CFU/kg丁酸梭菌可提高1～28日齡大腸桿菌K88攻毒肉雞的免疫應答，改善腸道屏障功能，提高平均日增重，促生長作用與硫酸黏菌素組(20 mg/kg)無顯著差異。Abdel-Latif等[60]研究發(fā)現(xiàn)，在1～35日齡科布肉雞飼糧中添加2.5×109CFU/kg丁酸梭菌和0.25 g/kg釀酒酵母，比單獨添加5×109CFU/kg丁酸梭菌更能改善肉仔雞的腸道健康和免疫功能，而且提高了生長性能。但Huang等[61]在21～23日齡羅斯308肉雞飼糧(魚粉含量占飼糧50%)中添加1×109CFU/kg丁酸梭菌并沒有改善產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎肉雞的腸道菌群組成，對腸道病變也無顯著影響。這可能是因為飼糧中纖維含量較低，不利于丁酸梭菌的生長繁殖。此外，甘露寡糖能夠顯著促進丁酸梭菌產(chǎn)生大量的丁酸[62]，這提示是否可將甘露聚糖酶與丁酸梭菌聯(lián)合用于腸道較短的禽類飼糧。

Zhan等[63]在48～58周齡京紅1號品系蛋雞飼糧中添加5×107和1×108CFU/kg丁酸梭菌可優(yōu)化盲腸菌群，增強免疫功能和抗氧化性能，改善蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。Wang等[19]在飼糧中添加丁酸梭菌2.7×109CFU/kg可加速60～68周齡海蘭褐蛋雞肝臟脂肪酸氧化，降低脂肪在肝臟中的沉積。張茜等[64]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加4.5×108CFU/kg丁酸梭菌和0.5%竹醋液，比分別單獨添加9×108CFU/kg丁酸梭菌、1%竹醋液更能提高61～69周齡蛋雞回腸總抗氧化能力和脂肪酶活性，降低回腸MDA含量，改善產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。

4.3 鴨

李娜等[65]給1日齡番鴨連續(xù)3 d灌服每次1 mL含2×109CFU/mL丁酸梭菌菌液，可提高1～10日齡番鴨的體重、回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值，上調(diào)回腸緊密連接蛋白——claudin-1、claudin-2和ZO-2的表達。趙文文等[66]在飼糧中添加5×107CFU/kg丁酸梭菌和800 mg/kg黃芪多糖，可提高1～28日齡紹興蛋雛鴨的免疫性能和抗氧化性能，改善腸道絨毛形態(tài)。Liu等[67]在飼糧中添加0.4×109～1.2×109CFU/kg丁酸梭菌，提高了1～42日齡北京鴨肝臟抗氧化性能，降低了肝脂肪變性和肝細胞壞死，對皮質(zhì)酮誘導的北京鴨肝損傷具有保護作用。

5 小 結(jié)

綜上所述，丁酸梭菌通過多種途徑發(fā)揮抗病和促進腸道健康的作用，是一種優(yōu)秀的綠色飼料添加劑，但是要取得與飼料用抗生素同樣的殺菌、促生長效果，還有一定的差距。丁酸梭菌的研究重點應該放在：1)利用基因工程技術(shù)，改良丁酸梭菌菌株，使其既能夠在腸道中快速產(chǎn)生大量丁酸，又能減少菌壁等自身成分對腸道的免疫刺激；2)深入研究丁酸梭菌抗病和促進腸道健康的主要作用機理；3)根據(jù)主要作用機理和各個品種畜禽的生理特點，尋找能夠與丁酸梭菌搭配使用，完全替代飼料用抗生素的合適中草藥、益生菌等，并合理配比使用；4)由于丁酸梭菌和肉毒梭狀芽孢桿菌同為梭菌屬，需深入研究丁酸梭菌將來可能出現(xiàn)的毒素基因水平轉(zhuǎn)移等生物安全性問題。