皇竹草與茅臺酒糟混合青貯對其養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的影響

李茂雅 成啟明 李 平 樊雪瑩 陳玉連 龍見華 陳 超

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化的發(fā)展，飼草飼料作為畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，對于促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及發(fā)展現(xiàn)代高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略有重要的作用[1]。我國的飼草資源主要來源于天然草地，占國土面積約42%，面積達(dá)到3.94億hm2，但是由于長期以來的不合理利用，草地普遍退化，飼草生產(chǎn)力明顯下降[2]。近年來，傳統(tǒng)飼草已經(jīng)無法滿足畜牧行業(yè)快速發(fā)展的需求，開發(fā)非常規(guī)飼草是草食畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一，同時可緩解我國飼草資源緊張，起到降低草食動物養(yǎng)殖的飼草成本和積極促進(jìn)現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的作用[3]。

皇竹草(PennisetumsineseRoxb)是由象草和美洲狼尾草雜交而來，它有著生物產(chǎn)量高、利用年限長以及抗病蟲害能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來，貴州省在貫徹落實國家供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、脫貧攻堅等政策推動下，皇竹草種植面積在逐年增加。2019年。貴州省累計種植面積2.24萬hm2，主要種植區(qū)域為畢節(jié)、安順、黔西南、黔東南和銅仁等地區(qū)[4]?；手癫莸厣仙锪烤薮螅戏椒N植的皇竹草地上生物量可達(dá)400 t/hm2[5]。研究表明，在飼料中添加適量的皇竹草，能改善動物的腸道炎癥，有利于動物的生長發(fā)育，降低養(yǎng)殖的飼料成本[6-8]。雖然皇竹草適宜在南方地區(qū)種植，但收獲期多集中在雨季，不利于青草保存，所以對其進(jìn)行青貯調(diào)制是最有效的利用方式。但皇竹草的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量較高，分別為76.92% DM和48.90% DM；可溶性碳水化合物(WSC)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量較低，分別為6.99% DM和3.71% DM；緩沖能較高，為97.83 E/kg DM，這導(dǎo)致其直接青貯難以獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料，所以對其進(jìn)行混合青貯是改善其青貯質(zhì)量的有效方式[9]。陳作棟等[10]研究表明，將皇竹草與花生秧混合進(jìn)行青貯，提升了青貯的發(fā)酵品質(zhì)，抑制了青貯中蛋白質(zhì)的水解，最適宜的混合比例是70%皇竹草和30%花生秧。王福春等[11]研究表明，將油菜秸稈與皇竹草混合進(jìn)行青貯，可以顯著提高錦江黃牛的飼糧表觀消化率，油菜秸稈與皇竹草按照3∶7比例進(jìn)行混合最適宜。

據(jù)統(tǒng)計，白酒與酒糟的產(chǎn)量比為1∶3，國內(nèi)每年酒糟生產(chǎn)量高達(dá)5 866萬t，其中茅臺酒糟的產(chǎn)量達(dá)到了15萬t以上，其水分含量高，易腐敗變質(zhì)，若不及時處理，大量的酒糟堆積會對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，酒糟的再利用是白酒行業(yè)面臨的嚴(yán)重難題。目前，關(guān)于酒糟飼料化利用的研究較多。賈春旺等[12]研究表明，添加青稞酒糟可以提高多年生黑麥草和紫花苜?；旌锨噘A的飼料發(fā)酵品質(zhì)，以添加20%青稞酒糟較為適宜。康坤[13]研究表明，甘薯蔓與酒糟、稻草混合青貯后，較好地保存了青貯料的養(yǎng)分含量，提高了青貯料的發(fā)酵品質(zhì)。以上研究表明，將酒糟和飼草進(jìn)行混合青貯可以有效改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，從而實現(xiàn)酒糟的飼料化利用。茅臺酒糟中CP和WSC含量分別為29.30% DM和8.30% DM，此外還含有豐富的氨基酸、粗纖維和粗脂肪等成分[14]。茅臺酒糟中豐富的養(yǎng)分含量正好能夠彌補(bǔ)皇竹草中養(yǎng)分含量單一和WSC含量低的缺點(diǎn)。因此，我們猜想皇竹草與茅臺酒糟混合青貯能夠獲得高品質(zhì)的青貯飼料，而目前關(guān)于皇竹草和茅臺酒糟此類研究還未見報道。

鑒于此，本試驗旨在研究皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯品質(zhì)的影響，通過對其養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性等指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，篩選出皇竹草與茅臺酒糟混合青貯的最適比例，旨在為皇竹草和茅臺酒糟飼料化利用提供科學(xué)依據(jù)，為緩解我國飼草資源緊缺和優(yōu)質(zhì)青貯產(chǎn)品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為在貴州省關(guān)嶺縣種植的皇竹草，以及從貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)茅臺集團(tuán)酒廠取回的茅臺酒糟。其原料的養(yǎng)分含量如表1所示，新鮮茅臺酒糟的CP、干物質(zhì)(DM)和WSC含量高于新鮮的皇竹草，而NDF和ADF含量低于新鮮的皇竹草。

表1 新鮮茅臺酒糟與皇竹草養(yǎng)分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計

本試驗設(shè)置4個皇竹草與茅臺酒糟的混合比例，分別為90%皇竹草+10%茅臺酒糟(H9J1)、80%皇竹草+20%茅臺酒糟(H8J2)、70%皇竹草+30%茅臺酒糟(H7J3)和60%皇竹草+40%茅臺酒糟(H6J4)，以鮮重為基礎(chǔ)。青貯45 d后，對皇竹草和茅臺酒糟原料以及不同混合比例處理的養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物進(jìn)行測定，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 青貯調(diào)制

將收獲的新鮮皇竹草切成2～3 cm長小段，按照試驗設(shè)計比例將皇竹草與茅臺酒糟充分混勻后，稱取300 g，裝入聚乙烯袋中，用真空機(jī)抽真空密封青貯。青貯袋封口后置于室溫下避光保存45 d。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 養(yǎng)分含量和發(fā)酵品質(zhì)測定

pH采用精密pH計測定；氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,AN)、乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量采用DB15/T 1458—2018[15]方法測定；DM含量測定方法參照張麗英[16]的飼料分析；CP含量采用凱氏定氮法(定氮儀KN680，ALVA儀器有限公司)測定[17]；WSC含量采用蒽酮-硫酸法[18]測定；NDF和ADF含量采用濾袋分析法[19]測定(ANKOM A-200i)。

1.4.2 微生物多樣性分析

將每個青貯處理中的3個重復(fù)樣品均勻地混合在一起。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取青貯飼料中的微生物組總DNA，利用前引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和后引物(5′-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3′)獲得細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4高變異區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序并對結(jié)果進(jìn)行分析。利用UCLUST比對工具，按97%的序列相似度，對操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)進(jìn)行歸并和劃分[20]，通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫的模板序列相對比，對OTU進(jìn)行分類地位的鑒定。利用Shannon、Simpson、Chao1和Ace這4個α多樣性指數(shù)來分析微生物菌群的豐富度和均勻度。使用QIIME軟件進(jìn)行各分類水平的分類學(xué)組成分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

由表2可知，H8J2、H7J3和H6J4處理青貯飼料中CP和WSC含量顯著高于H9J1處理(P<0.05)，而NDF和ADF(H8J2處理除外)含量顯著低于H9J1處理(P<0.05)。H7J3和H6J4處理青貯飼料中CP含量較高，都高于19.00%；WSC含量都高于2.40%。

表2 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

2.2 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知，H7J3處理青貯飼料的pH和AN含量都最低，顯著低于其他處理(P<0.05)。青貯飼料中LA含量最高的是H6J4處理，顯著高于其他處理(P<0.05)，最低的是H9J1處理。H8J2、H7J3和H6J4處理青貯飼料中AA含量顯著低于H9J1處理(P<0.05)。對于PA含量而言，H7J3處理青貯飼料中PA含量最低，為3.03 g/kg DM，顯著低于其他處理(P<0.05)。所有處理青貯飼料中都未檢測到BA。

表3 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例青貯飼料微生物多樣性分析

2.3.1 青貯飼料微生物α多樣性分析

由表4可知，所有原料和處理微生物α多樣性的覆蓋度(coverage)都達(dá)到了0.999，說明測序基本全面覆蓋所有微生物。α多樣性分析包括群落物種多樣性及豐富度的分析，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)用于表示群落物種的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于表示群落物種的多樣性程度。H8J2、H7J3和H6J4處理的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)高于H9J1處理，說明這3個處理的菌群豐富度高；H8J2、H7J3和H6J4處理的Simpson指數(shù)低于H9J1處理，說明這3個處理的菌群多樣性低。

表4 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例青貯飼料微生物α多樣性分析

2.3.2 青貯飼料微生物在門水平上的分布

由圖1可知，各原料和處理的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，其次是變形菌門(Proteobacteria)；除此之外，擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)也有少量存在，新鮮茅臺酒糟中軟壁菌門(Tenericutes)也有部分存在。H8J2和H7J3處理厚壁菌門的相對豐度相較于H9J1處理均有所提高，同時變形菌門的相對豐度都出現(xiàn)降低。

Unclassified：未分類；Other：其他；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌；Deinococcus-Thermus：異常球菌-棲熱菌門；Epsilonbacteraeota：埃普西隆桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Firmicutes：厚壁菌門。

2.3.3 青貯飼料微生物在屬水平上的分布

由圖2可知，新鮮皇竹草和新鮮茅臺酒糟中乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度較低，未分類和其他菌屬相對豐度較高，單獨(dú)青貯不易成功。青貯45 d后，H9J1、H8J2、H7J3和H6J4處理的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬，相對豐度分別為79.33%、73.74%、72.73%和58.55%；此外，與新鮮皇竹草相比，H9J1、H8J2、H7J3和H6J4處理的腸球菌屬(Enterococcus)相對豐度明顯減少。由此可見，皇竹草與茅臺酒糟混合青貯中的乳桿菌屬等有益菌相對豐度增加，腸球菌屬等有害菌相對豐度降低，且茅臺酒糟混合比例在10%～30%時，乳桿菌屬相對豐度較高，大于72.00%。

Unclassified：未分類；Other：其他；Clostridium_sensu_stricto_11：狹義梭菌屬11；Flavobacterium：黃桿菌屬；Corynebacterium_1：棒狀桿菌屬1；Stenotrophomonas：窄食單胞菌屬；Acetobacter：醋桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬。

3 討 論

3.1 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

本試驗中所使用的新鮮茅臺酒糟中DM、CP和WSC含量高于新鮮皇竹草，NDF和ADF含量低于皇竹草，所以皇竹草與茅臺酒糟進(jìn)行混合青貯可以改善青貯品質(zhì)。劉志云等[21]研究表明，茅臺酒糟的DM、CP和淀粉含量都比其他白酒糟含量高，這為微生物生長繁殖提供了良好的養(yǎng)分含量。高曉梅等[22]研究表明，DM含量高，可以抑制丁酸菌和大腸桿菌等有害菌的生長繁殖。本研究中，隨著茅臺酒糟混合比例的提高，各處理青貯飼料中CP含量逐漸提高，這與陳冬梅等[23]研究報道一致。CP含量增加的原因是新鮮酒糟本身的CP含量比較高。WSC含量越高，產(chǎn)生的LA越多，能快速降低環(huán)境的pH。本研究中，隨著茅臺酒糟混合比例的提高，各處理青貯飼料中WSC含量逐漸提高，這與Chiou等[24]結(jié)果一致，他們研究表明在象草青貯中添加高粱酒糟能增加其WSC含量。本研究中，當(dāng)茅臺酒糟的混合比例從10%提高到30%，皇竹草青貯的NDF和ADF含量呈現(xiàn)降低的趨勢，這與任海偉等[25]研究報道一致，其研究表明，白酒糟與菊芋渣混合青貯，青貯的NDF和ADF含量呈現(xiàn)降低的趨勢。NDF和ADF含量降低，說明了皇竹草與茅臺酒糟混合青貯有利于青貯原料中纖維的降解，增加青貯的飼用價值[26]。但是當(dāng)茅臺酒糟的混合比例增加到40%時，皇竹草青貯的NDF和ADF含量反而有所增加，這說明茅臺酒糟的混合比例不易過高。

3.2 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

研究表明，優(yōu)質(zhì)青貯飼料要求pH不大于4.2，不小于3.8[27]。在本研究中，H7J3處理的pH(3.82)符合優(yōu)質(zhì)青貯的標(biāo)準(zhǔn)。H8J2、H7J3和H6J4處理的LA含量高于H9J1處理，說明皇竹草與茅臺酒糟混合青貯有利于LA含量增加。本試驗發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，H7J3處理的LA含量高于H9J1處理，但差異不顯著，而H7J3處理的pH顯著低于H9J1處理，此結(jié)果與劉秦華等[28]的研究一致，可能的原因是青貯中的pH是由各種因素共同影響的，并不是LA單一決定的。研究表明，青貯中的PA含量低，對青貯的有氧穩(wěn)定性有積極作用[29]。本試驗中，H7J3處理的PA含量最低，說明H7J3處理的有氧穩(wěn)定性可能更高，這與孫安琪[30]的研究一致。如果青貯飼料中檢測到BA說明青貯飼料中含有梭菌，這會加劇青貯中DM的損失。在本研究中，所有處理都未檢測到BA，說明皇竹草與茅臺酒糟混合青貯有利于青貯飼料養(yǎng)分含量的保存[31]。Shao等[32]研究表明，青貯初期，青貯發(fā)酵以同型乳酸菌發(fā)酵為主，但后期以異型乳酸菌發(fā)酵為主，從而導(dǎo)致AA含量增高。本試驗中，H7J3和H6J4處理的AA含量低于其他2個處理，而且AA含量低于LA含量，這說明這2個處理可能主要以同型乳酸菌發(fā)酵為主；而H9J1和H8J2處理AA含量較高，且高于LA含量，說明這2個處理可能主要以異型乳酸菌發(fā)酵為主。AN含量可以反映青貯過程中蛋白質(zhì)和氨基酸的降解程度[33]。本試驗中，隨著茅臺酒糟混合比例的提高，其AN含量先降低后升高，在茅臺酒糟混合比例為30%時達(dá)到最低，為0.01 g/kg DM，這說明H7J3處理的蛋白質(zhì)水解程度最小，這與原現(xiàn)軍等[34]的研究結(jié)果一致。從發(fā)酵指標(biāo)綜合來看，皇竹草與茅臺酒糟混合比例為7∶3時的青貯品質(zhì)最好。

3.3 皇竹草與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料微生物多樣性的影響

青貯品質(zhì)的變化本質(zhì)是由微生物種類和數(shù)量的演繹變化引起的。厚壁菌門中的細(xì)菌大多屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，主要包括產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，可以降解纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)；而變形菌門是一類革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌，這些菌會跟乳酸菌競爭發(fā)酵底物，影響青貯的發(fā)酵品質(zhì)[35]。結(jié)合OTU統(tǒng)計和α多樣性分析，本試驗中，新鮮茅臺酒糟與新鮮皇竹草中的優(yōu)勢菌門為變形菌門，混合青貯后的各處理中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，這與陶蓮等[36]的研究結(jié)果一致。這說明皇竹草與茅臺酒糟混合青貯后有益菌豐度增加，從而抑制了有害菌的生長，降低了青貯飼料養(yǎng)分的消耗。從屬水平來看，新鮮茅臺酒糟和皇竹草原料中的優(yōu)勢菌屬為未分類和其他未識別的屬，而乳桿菌屬等有益菌含量很低，這說明這2種原材料單獨(dú)青貯時都不易成功[37]?；手癫菖c茅臺酒糟混合青貯的各處理的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬，而隨著茅臺酒糟混合比例的提高，皇竹草青貯中乳桿菌屬的相對豐度降低，在茅臺酒糟混合比例為10%～30%時，乳桿菌屬的相對豐度較高，大于72.00%。這可能是由于白酒糟中的復(fù)膜孢子酵母屬、伊薩酵母屬和曲霉屬豐度較高[38]，當(dāng)酒糟添加比例較高時，反而抑制了乳酸菌的生長。從微生物多樣性的角度來看，皇竹草與茅臺酒糟混合比例為7∶3時，可以很好地促進(jìn)青貯飼料中有益微生物的生長，抑制有害菌的繁殖，從而對青貯飼料品質(zhì)起到很好的促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

皇竹草與茅臺酒糟混合青貯能使青貯飼料的營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)均有不同程度的提升，并且能夠提高青貯中有益菌群的相對豐度，降低有害菌群的相對豐度。結(jié)合養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性等指標(biāo)綜合分析，皇竹草與茅臺酒糟混合比例為7∶3時，其混合青貯飼料品質(zhì)較好。