豬去氧膽酸對(duì)小鼠生長性能、能量代謝及脂肪消化吸收的影響

宋 敏 馬現(xiàn)永 張楓琳 王超普 蘇 含 江青艷 王松波*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000；4.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225)

豬去氧膽酸(hyodeoxycholic acid，HDCA)是一種天然的次級(jí)親水膽汁酸，在豬和鼠膽汁中含量豐富，在人的膽汁中也有發(fā)現(xiàn)[1-2]。據(jù)報(bào)道，HDCA可以防止膽結(jié)石的形成[3-4]。此外，HDCA具有降血脂、鎮(zhèn)痙、抑菌等多種生理作用，是一種重要的膽汁酸。作為一種膽汁酸，HDCA對(duì)動(dòng)物機(jī)體的脂質(zhì)代謝有著重要的調(diào)控作用。Sehayek等[2]在飼糧中添加0.05%～1.00% HDCA，發(fā)現(xiàn)其可能改變腸道膠束的理化性質(zhì)，導(dǎo)致膳食膽固醇的溶解和吸收下降，對(duì)治療小鼠血漿膽固醇含量升高和動(dòng)脈粥樣硬化有較好的效果，且隨著HDCA含量的增加，效果也越好。Shih等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1.25%的HDCA能通過改善高密度脂蛋白(HDL)功能來抑制低密度脂蛋白受體(LDLR)基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Liao等[6]研究了在正常飼料和高脂飼料中分別添加以HDCA為主的豬膽汁提取物對(duì)紅鰭東方鲀脂質(zhì)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)以HDCA為主的豬膽汁提取物能夠降低飼喂正常飼料的紅鰭東方鲀脂質(zhì)生成基因的轉(zhuǎn)錄，而增加飼喂高脂飼料紅鰭東方鲀的脂肪消化酶和脂質(zhì)/膽固醇運(yùn)輸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，2種飼料添加豬膽汁提取物后均有降低紅鰭東方鲀幼魚脂肪積累的趨勢(shì)。此外，本研究團(tuán)隊(duì)在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1 000 mg/kg的HDCA使斷奶仔豬的血清甘油三酯含量顯著降低，末重和平均日增重與對(duì)照組相比分別降低了3.76%和6.00%，且料重比顯著升高[7]，提示HDCA可能影響動(dòng)物機(jī)體的脂肪消化吸收與沉積。脂肪組織是人和動(dòng)物機(jī)體儲(chǔ)存和提供能量的主要組織，對(duì)維持機(jī)體的糖、脂代謝穩(wěn)態(tài)和能量代謝平衡至關(guān)重要。同時(shí)，脂肪組織也是內(nèi)分泌器官，能夠分泌多種脂肪因子和激素來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和能量平衡[8]。然而目前，關(guān)于HDCA對(duì)動(dòng)物機(jī)體脂肪沉積方面的影響卻鮮見報(bào)道。脂肪的消化吸收和能量代謝是影響脂肪沉積的重要因素。因此，本試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，探討HDCA對(duì)小鼠生長性能、褐色脂肪組織(BAT)和機(jī)體產(chǎn)熱以及呼吸熵等能量代謝、脂肪消化吸收方面的影響，為HDCA在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與材料

20只3周齡雄性無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6J小鼠和基礎(chǔ)飼糧均購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按體重將小鼠隨機(jī)分為2組，分別為對(duì)照組和HDCA組。對(duì)照組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼糧，HDCA組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼糧+1.5% HDCA的試驗(yàn)飼糧(HDCA的添加量由前期仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果和小鼠預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定，且此劑量對(duì)小鼠機(jī)體的正常代謝無顯著影響)，分籠飼養(yǎng)在溫度(24±1) ℃、濕度60%左右、光照與黑暗各12 h的環(huán)境中，自由采食和飲水，每周記錄小鼠的采食量，試驗(yàn)期為10周?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。HDCA購買于杭州某生物科技有限公司，含量為98%。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 生長性能和脂肪含量的測(cè)定

試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行空腹稱重，試驗(yàn)期間記錄小鼠的采食量。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算小鼠的體增重和平均日采食量(ADFI)。通過頸部脫臼方式處死小鼠，采集小鼠附睪脂肪組織(eWAT)、皮下脂肪組織(sWAT)及BAT并稱重，計(jì)算eWAT、sWAT及BAT的含量。

1.2.2 BAT產(chǎn)熱和基礎(chǔ)代謝的測(cè)定

試驗(yàn)第9周，采用紅外熱成像儀(美國菲力爾公司)測(cè)定小鼠在25和4 ℃環(huán)境溫度下的BAT產(chǎn)熱。采用代謝籠檢測(cè)系統(tǒng)(上海科之藍(lán)儀器有限公司)對(duì)小鼠的基礎(chǔ)代謝監(jiān)測(cè)24 h，分析小鼠的呼吸熵和產(chǎn)熱等代謝參數(shù)。

1.2.3 小鼠1周能量攝入和排出糞便能量的測(cè)定

試驗(yàn)第10周，記錄小鼠1周采食量，收集小鼠1周排出的全部糞便，105 ℃烘箱中烘干至恒重后稱重，粉碎，過40目篩，用于測(cè)定糞便的能值和粗脂肪含量。同時(shí)，收集2種飼糧并測(cè)定其能值和粗脂肪含量。飼糧和糞便能值用Parr-6400氧彈量熱儀測(cè)定，粗脂肪含量參照GB/T 6433—2006測(cè)定。按照以下公式計(jì)算小鼠1周能量攝入和排出糞便的能量：

小鼠1周能量攝入(kJ)=飼糧能值×小鼠1周采食量；小鼠1周排出糞便能量(kJ)=糞便能值×小鼠1周排出糞便總重量。

1.2.4 粗脂肪表觀消化率的測(cè)定

采用內(nèi)源指示劑—鹽酸不溶灰分法進(jìn)行粗脂肪表觀消化率的測(cè)定，飼糧和糞便中鹽酸不溶灰分含量參考GB/T 23472—2009測(cè)定。粗脂肪表觀消化率的計(jì)算公式如下：

粗脂肪表觀消化率(%)=100-100×(b×c)/(a×d)。

式中：a為飼糧中粗脂肪的含量；c為飼糧中鹽酸不溶灰分的含量；b為糞樣中粗脂肪的含量；d為糞便中鹽酸不溶灰分的含量。

1.2.5 胰脂酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

采集小鼠胰腺，按照HiPure Total RNA Mini kit試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)說明書，使用Trizol試劑對(duì)小鼠胰腺組織的總RNA進(jìn)行提取。采用Synergy 2型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)測(cè)定RNA濃度，根據(jù)260與280 nm處吸光度的比值判斷其純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取0.25 μL上游引物，0.25 μL下游引物，6.5 μL無核酸水，3 μL cDNA和10 μL的SYBR Green Master Mix，混合成20 μL的體系。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，使用熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)通過其特異性引物擴(kuò)增目的基因mRNA。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因PCR特異性引物，引物序列如表2所示，引物由上海生物工程有限公司合成。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，95 ℃變性15 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算出目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較2組數(shù)據(jù)間的差異，P<0.05和P<0.01分別代表差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HDCA對(duì)小鼠生長性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加HDCA對(duì)小鼠的ADFI和終末體重?zé)o顯著影響(P>0.05)，但顯著降低了小鼠的體增重(P<0.05)。此外，飼糧添加HDCA對(duì)小鼠eWAT含量和BAT含量無顯著影響(P>0.05)，但卻顯著減少了小鼠的sWAT含量(P<0.05)，提示飼糧添加HDCA可能影響小鼠的皮下脂肪生成和沉積，從而降低了體增重。

表3 飼糧中添加HDCA對(duì)小鼠生長性能的影響

2.2 HDCA對(duì)小鼠能量代謝的影響

如圖1-A、圖1-B所示，與對(duì)照組相比，在25和4 ℃環(huán)境溫度下，飼糧添加HDCA均能增加小鼠的BAT溫度，即產(chǎn)熱(P<0.05)。同時(shí)，基礎(chǔ)代謝試驗(yàn)結(jié)果顯示，HDCA能極顯著降低小鼠白天和黑夜的呼吸熵(P<0.01)(圖1-C、圖1-D)，并增加小鼠的機(jī)體產(chǎn)熱(P<0.05和P<0.01，圖1-E、圖1-F)，從而提高了小鼠的基礎(chǔ)代謝。以上結(jié)果表明，HDCA能提高小鼠的能量代謝。

A和B：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠BAT溫度的影響；C和D：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠呼吸熵的影響；E和F：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠產(chǎn)熱的影響。*、**分別表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

2.3 HDCA對(duì)小鼠脂肪消化吸收的影響

如圖2-A、圖2-B所示，與對(duì)照組相比，HDCA組小鼠的1周能量攝入沒有顯著差異(P>0.05)，但卻顯著增加了由糞便排出的能量(P<0.01)。同時(shí)，HDCA組小鼠糞便的粗脂肪含量極顯著升高(P<0.01)，粗脂肪表觀消化率極顯著降低(P<0.01；圖2-C、圖2-D)。此外，由圖2-E可知，飼糧添加HDCA有降低小鼠胰腺膽鹽刺激性脂酶(bile salt-stimulated lipase，BSSL)、磷脂酶A2(pancreatic phospholipase A2，PLA2)、甘油三酯脂酶(pancreatic triglyceride lipase，PTL)、胰脂酶相關(guān)蛋白1(pancreatic lipase-related protein 1，PLRP1)和胰脂酶相關(guān)蛋白2(PLRP2)mRNA表達(dá)量的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。以上結(jié)果表明，飼糧添加HDCA能夠降低小鼠腸道內(nèi)脂肪的消化吸收。

A：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠1周能量攝入的影響；B：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠1周排出糞便能量的影響；C：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠糞便中粗脂肪含量的影響；D：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠粗脂肪表觀消化率的影響；E：飼糧添加HDCA對(duì)小鼠胰腺中膽鹽刺激性脂酶(BSSL)、磷脂酶A2(PLA2)、甘油三酯脂酶(PTL)、胰脂酶相關(guān)蛋白1(PLRP1)和2(PLRP2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 HDCA對(duì)小鼠生長性能的影響

Watanabe等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在高熱量飼糧中添加0.3%的HDCA飼喂小鼠4周對(duì)其采食量和末重?zé)o顯著影響。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加1.5%的HDCA對(duì)小鼠的采食量和終末體重?zé)o顯著影響，但顯著降低了小鼠的體增重。造成這種差異的原因可能是小鼠飼糧類型、HDCA飼喂量以及飼養(yǎng)時(shí)間的不同。有研究表明，飼糧中添加HDCA能夠治療小鼠血漿膽固醇含量升高和動(dòng)脈粥樣硬化，且在0.05%～1.00% HDCA范圍內(nèi)，HDCA含量越高，效果越好[2]，說明HDCA的劑量能夠影響試驗(yàn)效果。在生長性能方面，與本試驗(yàn)結(jié)果類似，Shih等[5]發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加1.25%的HDCA使LDLR基因敲除小鼠的脂肪含量降低，且體重比對(duì)照組降低了10%，然而小鼠的血清生理生化結(jié)果表明，HDCA的添加并沒有提高血清中任何器官毒性標(biāo)志物的水平。相反，添加HDCA的小鼠血清中的肝臟毒性標(biāo)志物，如總膽紅素含量及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)活性均顯著低于對(duì)照組，說明在飼糧中添加1.25%左右的HDCA并不會(huì)影響小鼠的整體健康水平。此外，前期試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1 000 mg/kg的HDCA使斷奶仔豬的終末體重和ADG比對(duì)照組分別降低了3.76%和6.00%，這可能跟腸道中與體重增加和肝臟中甘油三酯含量呈負(fù)相關(guān)的副擬桿菌屬(Parabacteroides)的相對(duì)豐度升高有關(guān)[7]。而本試驗(yàn)中HDCA組小鼠體增重的降低是否跟腸道中Parabacteroides相對(duì)豐度有關(guān)則需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HDCA對(duì)小鼠的eWAT和BAT含量無顯著影響，但卻顯著減少了小鼠的sWAT含量，說明HDCA組小鼠體增重的降低可能跟小鼠皮下脂肪沉積的減少有關(guān)。

3.2 HDCA對(duì)小鼠能量代謝的影響

機(jī)體能量代謝水平是影響脂肪沉積的重要因素。因此，本試驗(yàn)通過測(cè)定小鼠的BAT產(chǎn)熱和基礎(chǔ)代謝來研究HDCA對(duì)小鼠機(jī)體能量代謝的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加HDCA能夠增加25和4 ℃環(huán)境溫度下小鼠的BAT產(chǎn)熱。同時(shí)，HDCA還能降低小鼠的呼吸熵并增加小鼠機(jī)體產(chǎn)熱。以上結(jié)果說明，HDCA能夠通過增加BAT產(chǎn)熱和基礎(chǔ)代謝提高小鼠的能量代謝，從而降低小鼠的sWAT含量。多項(xiàng)研究表明，膽汁酸可作為信號(hào)分子，通過激活膽汁酸體參與機(jī)體的能量代謝等調(diào)節(jié)過程[9]。Watanabe等[10]發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(TGR5)激活后能提高細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素活性，從而增加了BAT產(chǎn)熱，逆轉(zhuǎn)了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和BAT中的脂肪沉積。Broeders等[11]的研究也表明，鵝去氧膽酸能通過TGR5促進(jìn)人類BAT的線粒體解偶聯(lián)，并增加了12名健康女性BAT的活性和全身的能量消耗[12]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)法尼醇X受體(FXR)的激活也可能影響全身能量穩(wěn)態(tài)。因此，HDCA提高小鼠的能量代謝可能跟小鼠體內(nèi)膽汁酸受體的激活有關(guān)。

3.3 HDCA對(duì)小鼠脂肪消化吸收的影響

Watanabe等[1]的研究表明，HDCA能夠下調(diào)小鼠肝臟中脂肪酸從頭合成和飽和脂肪酸的去飽和相關(guān)酶的基因表達(dá)水平。同時(shí)，HDCA能夠降低小鼠的血清總脂肪酸、肝臟膽固醇酯和肝臟甘油三酯的含量，從而發(fā)揮降血脂作用。此外，Liao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，以HDCA為主的豬膽汁提取物能夠增加飼喂高脂飼料紅鰭東方鲀的脂肪消化酶和脂質(zhì)/膽固醇運(yùn)輸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。與前人的研究結(jié)果相一致，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，HDCA在未影響小鼠能量攝入的前提下，降低了小鼠的粗脂肪表觀消化率，從而增加了小鼠糞便中的粗脂肪含量和能量。此外，HDCA還有降低小鼠胰腺胰脂酶相關(guān)基因BSSL、PTL、PLA2、PLRP1及PLRP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的趨勢(shì)。BSSL和PLRP2是人類和動(dòng)物在新生兒階段的主要胰脂酶，兩者協(xié)同作用，能夠更高效地水解甘油三酯、膽固醇及磷脂，有利于腸道細(xì)胞對(duì)脂肪的吸收，對(duì)斷奶前的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[13]。PTL和PLA2則是斷奶后和成年期乳脂顆粒中水解甘油三酯的主要胰脂酶，哺乳期的胰腺幾乎不表達(dá)PTL和PLA2，直到斷奶后才能檢測(cè)到，并逐漸增加至成年期水平[14]。PLRP1本身并沒有脂解作用，它可能通過與PLRP2和PTL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合輔酶而間接影響脂肪的消化吸收[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，HDCA可能通過下調(diào)生命早期和成年期胰脂酶相關(guān)基因表達(dá)水平來減少小鼠對(duì)脂肪的消化吸收，從而降低小鼠的體增重和皮下脂肪沉積。

4 結(jié) 論

飼糧添加1.5%的HDCA能夠增加小鼠BAT和機(jī)體產(chǎn)熱，降低呼吸熵，提高能量代謝，同時(shí)減少小鼠對(duì)脂肪的消化吸收，從而降低小鼠的sWAT含量和體增重。