鎘、鉛、汞、鉻和硒聯(lián)合暴露對蛋雞肝臟、腎臟、脛骨及血清中金屬離子穩(wěn)態(tài)的影響

張雨薇 李 浪 姜宇軒 宋景平 劉光芒 王建萍 林 燕 白世平 張克英 吳彩梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，四川省農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，成都 611130)

我國蛋雞存欄量、雞蛋產(chǎn)量、禽料產(chǎn)量屢創(chuàng)新高，飼料安全直接影響了蛋雞的安全生產(chǎn)和雞蛋安全。鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鉻(Cr)等重金屬(heavy metal，HEM)在動物生存環(huán)境、飼料和動物可食性組織中同時存在，且含量較高。畜禽飼料中重金屬主要來源于環(huán)境及礦物質(zhì)添加劑。已有大量調(diào)研數(shù)據(jù)顯示，我國各省市的畜禽飼料存在嚴(yán)重重金屬超標(biāo)現(xiàn)象[1-2]。Cd、Pb、Hg為畜禽非必需金屬元素，可在動物各組織沉積，危害生殖器官，引起離子紊亂。Cr為畜禽必需金屬元素，但過量添加同樣會導(dǎo)致動物中毒。研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼糧途徑單一重金屬暴露[Cr、Pb、Cd、釩(V)及鉬(Mo)]可引起重金屬沉積和必需金屬離子紊亂，降低蛋雞產(chǎn)蛋率和雞蛋中必需金屬元素含量[3-8]。Kim等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼糧途徑兩兩聯(lián)合暴露不同含量的重金屬(Hg+Pb、Pb+Cd、Hg+Cd)，可引起血漿、腎臟、脛骨、肝臟和肌胃等組織重金屬沉積。Hallak等[10]和Jordan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鴨飼糧途徑3種重金屬聯(lián)合暴露(Cd+Pb+Hg)對肝臟的毒性大于兩兩聯(lián)合暴露(Hg+Pb、Pb+Cd、Hg+Cd)。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加亞硒酸鈉可降低部分飼糧重金屬在肉雞肌肉、肝臟、腎臟等組織中的沉積量[12-15]。但Jihen等[16]研究卻發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉對雄性大鼠Cd中毒無明顯緩解作用。Xing等[17]研究結(jié)果顯示，酵母硒可緩解Cd導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，恢復(fù)硒蛋白表達(dá)水平，減少肝細(xì)胞焦亡。

雖然我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了相應(yīng)重金屬的限量，但是由于利益驅(qū)使、管控力度不夠以及礦物質(zhì)添加劑的劣質(zhì)，仍然會有飼料及生產(chǎn)環(huán)節(jié)中重金屬超標(biāo)的現(xiàn)象，尤其是Pb和Cr。目前，國內(nèi)外有關(guān)重金屬及硒對重金屬毒性的緩解研究主要集中在單一或兩兩重金屬暴露，但實際生產(chǎn)中各種重金屬同時存在，而有關(guān)多種重金屬聯(lián)合暴露對蛋雞的金屬離子穩(wěn)態(tài)的研究較少。因此，本試驗旨在探索多種重金屬聯(lián)合暴露對蛋雞肝臟、腎臟、脛骨及血清中金屬離子穩(wěn)態(tài)的毒性及Se的緩解作用，為進(jìn)一步保障蛋雞飼料安全和人類食品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物選用160只處于產(chǎn)蛋后期(63周齡)的健康粉殼羅曼蛋雞。

1.2 試驗設(shè)備及試劑

1.2.1 試驗設(shè)備

高分辨率連續(xù)光源原子吸收光譜儀(ContrAA 700，德國Analytik Jena公司)、智能微波消解儀(CEM-MARS6，上海博通化學(xué)科技有限公司)、雙道原子熒光光度計(AES-230E，北京海光儀器公司)、測汞儀(DMA 80 evo，意大利Milestone公司)。

1.2.2 試驗試劑

氯化鎘(CdCl2，分析純)、氯化鉻(CrCl3，分析純)、硝酸鉛[(Pb(NO3)2，分析純]、氯化汞(HgCl2，分析純)、濃硝酸、高氯酸(成都市科龍化工試劑廠)，酵母硒(0.2%，吉隆達(dá)生物科技有限公司)，氧化鑭(La2O3，成都市科龍化工試劑廠)、氯化銫(CsCl，上海生工生物技術(shù))、超純水。Hg、Cr、Se標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)和Cd、Pb、Cu、Fe、Mn、Zn、Na、K、Mg、Ca標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。

1.3 試驗設(shè)計

選擇160只63周齡的健康粉殼羅曼蛋雞，隨機(jī)分為4個組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)4只雞。對照組(CON組)飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，加硒組(Se組)在基礎(chǔ)飼糧中添加0.4 mg/kg Se(酵母硒)，重金屬聯(lián)合暴露組(HEM組)基礎(chǔ)飼糧中添加5 mg/kg Cd(CdCl2)、5 mg/kg Cr(CrCl3)、50 mg/kg Pb[Pb(NO3)2]和3 mg/kg Hg(HgCl2)，重金屬聯(lián)合暴露加硒組(HEM+Se組)在HEM組飼糧中添加0.4 mg/kg Se(酵母硒)。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，基礎(chǔ)飼糧金屬離子含量見表2。預(yù)試期1周，正試期12周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kg of the diet: VA 10 000 IU，VD 2 500 IU，VE 6.25 IU，VK3 1.25 mg，VB1 0.50 mg，VB2 4.00 mg，VB6 1.5 mg，VB12 0.007 5 mg，泛酸 pantothenic acid 6.25 mg，煙酸 niacin 8.75 mg，生物素 biotin 0.012 5 mg，葉酸 folic acid 0.125 mg。

表2 基礎(chǔ)飼糧金屬離子含量(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)所試驗場進(jìn)行。采用3層全階梯籠養(yǎng)，保證每天16 h光照，舍內(nèi)溫度控制在25 ℃左右，試驗全期自由采食和飲水。

1.5 樣品采集和測定指標(biāo)

飼糧配制完成后，按照四分法采樣，采集基礎(chǔ)飼糧和試驗飼糧各250 g于自封袋中，4 ℃保存。試驗第12周末，從每個重復(fù)中隨機(jī)選取2只雞(每組20只，共80只)，翅靜脈采血并提取血清，采集脛骨、肝臟、腎臟樣品，-20 ℃保存。參照羅成等[18]的方法測定Cd、Cr、Pb含量，參照GB 5009.17—2014[19]的方法測定Hg含量，參照王宏慧等[20]的方法測定Cu、Fe、Mn、Zn、Na、K、Mg、Ca含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 9.4軟件的PROC MIXED模型對肝臟、腎臟、脛骨及血清中金屬離子含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間采用Tukey法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。采用SPSS 26.0軟件的Pearson相關(guān)檢驗分析肝臟、腎臟、脛骨及血清中各金屬離子之間的相關(guān)性，r>0.50和P<0.05認(rèn)為相關(guān)關(guān)系顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重金屬對蛋雞肝臟中金屬離子平衡的毒性及Se的緩解效果

肝臟中金屬離子含量變化如圖1所示。與CON組相比，HEM組肝臟中Cd、Pb、Hg、Fe、Zn、K含量顯著升高(P<0.05)，Se組和HEM+Se組肝臟中Se含量顯著升高(P<0.05)。與HEM組相比，HEM+Se組肝臟中Cd、Pb、Fe、Zn、K含量無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

肝臟中金屬離子含量的相關(guān)性如表3所示。肝臟中13種金屬離子含量之間共存在19種顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。其中，Cd含量與Pb、Hg、Fe含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Pb含量與Cd、Hg、Fe、Zn含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Cr含量與Na含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Hg含量與Cd、Pb、Fe、Zn、Mn含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Cu含量與Mn、Zn、Mg含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Fe含量與Cd、Pb、Hg、Zn含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Mn含量與Mg、Hg、Cu含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Zn含量與Pb、Hg、Cu、Fe含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Na含量與Cr含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與K和Mg含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；K含量與Na含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Mg含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 肝臟中金屬離子含量的相關(guān)性

2.2 重金屬對蛋雞腎臟中金屬離子平衡的毒性及Se的緩解效果

腎臟中金屬離子含量變化如圖2所示。與CON組相比，HEM組腎臟中Cd、Hg、Pb含量顯著升高(P<0.05)。與HEM組相比，HEM+Se組腎臟中Cd、Pb、Hg含量無顯著差異(P>0.05)。

圖2 重金屬對腎臟中金屬離子含量的影響及Se的緩解效果

腎臟中金屬離子含量的相關(guān)性如表4所示。腎臟中13種金屬離子含量之間共存在12種顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。其中，Cd含量與Pb、Hg、Fe、Zn含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Pb含量與Cd、Hg、Zn含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Hg含量與Cd、Pb、Zn含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Cu含量與Zn、K含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Fe含量與Cd、Ca含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Zn含量和Cd、Pb、Hg、K含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；K含量和Cu、Zn、Mg含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表4 腎臟中金屬離子含量的相關(guān)性

2.3 重金屬對蛋雞血清中金屬離子平衡的毒性及Se的緩解效果

血清中金屬離子含量變化如圖3所示。與CON組相比，HEM組血清中Se、Mn、Mg、Ca含量顯著下降(P<0.05)；Se組血清中Se含量顯著升高(P<0.05)，血清中Mn、Mg、Ca含量顯著下降(P<0.05)。與HEM組相比，HEM+Se組血清中Hg含量顯著升高(P<0.05)，血清中Mn、Mg、Ca含量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 重金屬對血清中金屬離子含量的影響及Se的緩解效果

血清中金屬離子含量的相關(guān)性如表5所示。血清中13種金屬離子含量之間共存在12種顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。其中，Hg含量與Mn、Mg含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Mn含量與Hg含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Zn、Mg、Ca含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Zn含量與Mn、Mg、Ca含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Na含量與K、Mg、Ca含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；K含量與Mg含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Mg含量與Mn、Zn、Na、K、Ca含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Hg含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表5 血清中金屬離子含量的相關(guān)性

2.4 重金屬對蛋雞脛骨中金屬離子平衡的毒性及Se的緩解效果

脛骨中金屬離子含量變化如圖4所示。與CON組相比，HEM組脛骨中Cd、Pb、Hg、Se、Na、K含量顯著升高(P<0.05)，脛骨中Mn含量顯著降低(P<0.05)。與HEM組相比，HEM+Se組脛骨中Pb、Se含量顯著升高(P<0.05)，脛骨中Na、K含量顯著降低(P<0.05)，脛骨中Cd、Hg、Mn含量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 重金屬對脛骨中金屬離子含量的影響及Se的緩解效果

脛骨中金屬離子含量的相關(guān)性如表6所示。脛骨中13種金屬離子含量之間共存在7種顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。其中，Cd含量與Pb、Hg、Se含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Pb含量與Cd、Hg、Se含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Hg含量與Cd、Pb含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Zn含量與Mg含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Se含量與Cd、Pb含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Na含量與K含量顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表6 脛骨中金屬離子含量的相關(guān)性

3 討 論

飼料及動物性食品中重金屬污染通過食物鏈威脅動物和人類的健康[21]，雞蛋中的重金屬含量與攝入飼料受重金屬污染程度呈正相關(guān)[22]。我國各省市飼料原料均有重金屬超標(biāo)現(xiàn)象，各飼料原料中Cr超標(biāo)率可達(dá)100%，Pb超標(biāo)率高達(dá)30%以上[2]。我國飼料原料中Cd、Cr、Pb、Hg、Se的國家標(biāo)準(zhǔn)限量分別為0.5、5.0、5.0、0.1和0.5 mg/kg[23-24]。本試驗結(jié)合國家限量標(biāo)準(zhǔn)和重金屬的污染情況設(shè)計了聯(lián)合重金屬暴露的劑量。酵母硒因其高生物利用度在畜禽中被廣泛使用，本試驗結(jié)合國家限量設(shè)計了其添加劑量。

3.1 聯(lián)合重金屬暴露增加了相應(yīng)重金屬的沉積

本試驗結(jié)果顯示，聯(lián)合重金屬暴露引起蛋雞肝臟、腎臟、脛骨中Cd、Pb、Hg的含量顯著升高。飼糧中重金屬在腸道吸收，經(jīng)尿液或糞便排出，無法隨糞尿排出的重金屬沉積在體內(nèi)的各個部位，以肝臟、腎臟為主[25]。本研究中，腎臟中Cd含量最高，與Tsuruoka等[26]的研究結(jié)果一致，其沉積原理可能是：Cd隨血液循環(huán)進(jìn)入肝臟后，首先與金屬硫蛋白(MT)結(jié)合形成絡(luò)合物Cd-MT，Cd-MT一般會先到達(dá)腎臟，通過腎小管膜進(jìn)入管狀體后幾乎在近曲小管被完全吸收，之后再通過胞飲作用進(jìn)入腎小管溶酶體降解，分離并釋放出游離的Cd發(fā)揮毒性作用。脛骨中Pb含量最高，這與楊曉剛等[27]的研究結(jié)果吻合，其原因可能與脛骨中Pb的存在形式有關(guān)，蛋雞體內(nèi)95%的Pb以不溶性磷酸Pb的形式與骨骼中的一些化合物結(jié)合形成穩(wěn)定有機(jī)鹽，長期蓄積在骨骼中。Hg化合物主要經(jīng)動物腸道消化，其中有7%～15%被進(jìn)一步吸收，主要沉積到腎臟中[22]。

3.2 聯(lián)合重金屬暴露引起金屬離子失衡的可能原因

研究表明，飼糧中聯(lián)合重金屬暴露能引起組織中金屬離子紊亂，重金屬離子之間可能存在協(xié)同關(guān)系[7-10]。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析結(jié)果表明，機(jī)體內(nèi)的離子失衡與重金屬的蓄積有關(guān)。肝臟中13種金屬離子含量之間存在19種顯著的相關(guān)關(guān)系，其中Cd含量與Fe含量，Hg含量與Zn含量，Pb含量與Zn含量以及Fe含量與Zn含量之間都存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這與Mouro等[28]發(fā)現(xiàn)的肝臟中Cd含量與Fe含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系不同，原因可能與Cd的毒性作用有關(guān)。Cu與Zn、Mn一起作為超氧化物歧化酶(SOD)的輔助因子，在對超氧化物[29]引起的氧化損傷的第一反應(yīng)中具有活性，而Cd由于與Cu、Fe、Mn等離子存在競爭性結(jié)合，可以增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致蛋雞體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)損傷；同時，Cd的競爭性結(jié)合使SOD活性中心的二價離子解離，導(dǎo)致組織中金屬離子含量升高，引起蛋雞組織中金屬離子紊亂。腎臟中13種金屬離子含量之間存在12種顯著的相關(guān)關(guān)系，Armbrecht等[30]研究顯示，腎臟中Cd含量與Ca含量呈負(fù)相關(guān)，其原因是高含量的Cd會影響腎小球的形態(tài)和正常的生理功能，而腎小球是1,25-二羥基維生素D32-D3[1,25-(OH)]轉(zhuǎn)化為活性形式的場所，腎小球的結(jié)構(gòu)和功能受損會降低血清中1,25-(OH)2-D3含量，進(jìn)而導(dǎo)致Ca含量的降低。但在本試驗中，腎臟中Cd含量與Ca含量無顯著相關(guān)性，而Fe含量與Ca含量呈顯著正相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果不一致，可能是因為Fe與Cd競爭腸道中的二價金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1(DMT1)，減少了Cd的吸收[31]，使Cd含量無法對Ca含量產(chǎn)生顯著影響。血清中13種金屬離子含量之間存在12種顯著的相關(guān)關(guān)系，Mn含量與Zn、Mg、Ca含量均存在顯著正相關(guān)，Mg含量與Ca含量也存在顯著正相關(guān)，這與Liu等[32]的研究結(jié)果一致。機(jī)體組織和體液中必需金屬的含量反映動物的病理和營養(yǎng)狀況[33]。Cd、Pb、Hg降解性差，易在動物心臟、肝臟、腎臟、輸卵管和骨骼等組織中蓄積，競爭性地與其他必需營養(yǎng)素爭奪相同的跨膜載體，擾亂體內(nèi)微量元素的平衡，造成神經(jīng)、生殖等系統(tǒng)毒性，威脅雞蛋安全[34-37]。脛骨中13種金屬離子含量之間存在7種顯著的相關(guān)關(guān)系，且主要是在重金屬元素之間，說明重金屬元素在脛骨中的關(guān)系可能是協(xié)同作用。

多個因素間的相互作用明確分為累加、協(xié)同、拮抗和獨(dú)立[38]。秦衛(wèi)紅等[39]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧途徑重金屬聯(lián)合暴露(Pb+Cd、Pb+Hg和Hg+Cd)導(dǎo)致重金屬在蛋雞組織中的沉積加劇，可能具有協(xié)同效應(yīng)。Kim等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧途徑Pb+Hg聯(lián)合暴露8周，蛋雞血漿中Pb、Hg含量顯著增加。相關(guān)性分析結(jié)果表明，肝臟、腎臟和脛骨中Cd、Pb、Hg之間可能為協(xié)同作用；在腎臟中，F(xiàn)e與Cd可能為拮抗作用，與Ca、Zn可能為協(xié)同作用。

3.3 Se對金屬離子穩(wěn)態(tài)的影響

組織中Se含量反映機(jī)體對Se的吸收利用率，Se可部分緩解有害重金屬在肝臟、腎臟等組織中的沉積[40-41]。本研究中，HEM+Se組血清Hg含量顯著高于HEM組，可能是因為Hg暴露影響血清中Se含量和硒蛋白的分布，硒蛋白P在較高的Hg暴露濃度下會結(jié)合更多的Hg[42]。在本研究中，與CON組相比，Se組脛骨中Se含量無顯著差異，但HEM組和HEM+Se組脛骨中Se含量顯著升高，且HEM+Se組脛骨中Se含量顯著高于HEM組，與鞠耿越[43]研究結(jié)果不同，可能是因為在聯(lián)合重金屬暴露過程中重金屬的存在使Se向脛骨轉(zhuǎn)移，促進(jìn)了Se的排出，但具體的機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，Cd、Pb、Hg、Cr聯(lián)合暴露增加了相應(yīng)重金屬元素的沉積，擾亂了蛋雞肝臟、腎臟、血清、脛骨中金屬離子穩(wěn)態(tài)，飼糧中添加0.4 mg/kg酵母硒未能緩解重金屬暴露引起的金屬離子紊亂毒性。