松花粉對環(huán)磷酰胺致卵巢早衰大鼠的卵巢保護作用

何毓婕，曲 濤，王 桐，何志勇，王召君，秦 昉，曾茂茂，陳 潔*

1江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，無錫 214122；2煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，煙臺 264000

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指卵巢功能衰竭所致的40歲之前閉經(jīng)的現(xiàn)象，其特點是促性腺激素水平的升高和雌激素水平的降低[1]，卵巢早衰還可能導(dǎo)致不孕等臨床癥狀。POF的發(fā)生率約為1%～3%，且有逐漸升高和年輕化的趨勢[2]。多種因素可誘發(fā)POF，如環(huán)境因素、遺傳因素和疾病因素等[3]。因此，POF的預(yù)防和治療受到了全社會的廣泛關(guān)注。

目前，POF常用的治療方法是激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)，如使用天然雌激素雌二醇或孕激素黃體酮等[3]。在腫瘤患者中，促性腺激素釋放的激素類似物也被證明在預(yù)防化療引起的POF具有較好的效果[4]。然而，使用激素替代療法可能會帶來更高的罹患乳腺癌、中風(fēng)和膽囊疾病風(fēng)險[5,6]。眾所周知，中草藥特別是傳統(tǒng)的藥食兩用材料具有很高的安全性。有研究表明，中草藥治療比HRT治療在降低FSH水平方面具有更好的效果[7]。因此，開發(fā)基于藥食同源的更加安全有效的卵巢保護產(chǎn)品對于維護人民身體健康具有重要意義。

松花粉是馬尾松或油松等幾種同屬植物的雄性生殖細(xì)胞，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、酶、維生素、礦物質(zhì)、核酸、黃酮、多糖、膽堿、植物甾醇等200多種營養(yǎng)和活性物質(zhì)，被報道具有保護肝臟、增強免疫力和抗腫瘤作用[8]，以及減少炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的能力[9]。此外，松花粉也被證實具有保護前列腺的作用[10]，這表明其可能具有保護生殖系統(tǒng)的能力。松花粉中多糖的含量較高，且其結(jié)構(gòu)與枸杞和當(dāng)歸多糖相似，而枸杞多糖[11]和當(dāng)歸多糖[12]被報道具有卵巢保護特性。松花粉中還含有大量柚皮素[13]，而柚皮素被認(rèn)為具有雌激素樣作用，可以與雌激素受體結(jié)合以維持生理功能[14]。因此，松花粉具有卵巢保護的潛力，但目前松花粉的功能研究很少涉及到卵巢保護。

本文采用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導(dǎo)建立POF大鼠模型，灌胃高中低3種劑量的松花粉懸液，研究松花粉對卵巢形態(tài)、血清激素水平、炎癥因子濃度、卵巢抗氧化酶活性以及抗顆粒細(xì)胞凋亡的作用及可能機制，以期為基于卵巢保護的松花粉功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及環(huán)境

SD大鼠(雌性，10周齡，體重約250 g)，浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證SCXK(浙)2019-0001，飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃，濕度55%～70%，照度15～20lx的屏障設(shè)施內(nèi)，每籠4只，照明時間為每天12 h，期間自由進食飲水。

1.2 藥品與試劑

破壁云南松花粉(新時代健康產(chǎn)業(yè)(集團)有限公司)；環(huán)磷酰胺一水合物(Cyclophosphamide monohydrate)(美國Sigma公司，批號為：WXBD0060V)；紅麗來結(jié)合雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司，批號為：20200404)；大鼠雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、抗苗勒試管激素(anti-Muller tube hormone，AMH)、抑制素B(Inhibin B，INHB)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)Elisa試劑盒(武漢伊萊特生物科技股份有限公司，批號分別為：X2EMIUXXF8、ISDMZHEPUL、DPGZG43U1U、QVZHNJPL6W、J2W5 REJ4J2、XDUTTUKQH7、F5W496GZSQ、V8TD13EG W9)；總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活力、過氧化氫酶(catalase，CAT)活力測定試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、伊紅-蘇木素(hematoxylin and eosin，H&E)染色試劑盒，一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號分別為：S0119、S0101S、S0056、S0051、P0010S、C0105M、C1088)；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體(英國Abcam公司，批號分別為：GR3275117-9、GR249198-97、GR3241586-15)；Cleaved Caspase-3抗體(美國CST公司，批號為：47)。

1.3 儀器與設(shè)備

SpectraMax190酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司)；GZP-150N光照培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)；3K15冷凍離心機(美國Sigma公司)；XB70雪花制冰機(美國Grant公司)；SB5200超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；IKA VORTEX 3旋渦混勻儀、C-MAG HS7磁力攪拌儀(德國IKA儀器有限公司)；Spectra MAX 190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Leica ASP300S型全自動脫水機、Leica RM2255型半自動切片機、Leica TS5015型全自動染色機(德國徠卡儀器有限公司)；奧林巴斯BX51型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)儀器設(shè)備有限公司)；Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、164-5050基礎(chǔ)電源電泳儀、165-8003小型垂直電泳槽(美國伯樂公司)；iBright FL1500成像系統(tǒng)(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、造模及給藥

取雌性SD大鼠48只，體重250 ± 10 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組8只，分別為空白對照組、卵巢早衰模型組、陽性藥物對照組、松花粉高、中、低劑量組?？瞻讓φ战M腹腔注射生理鹽水，其余組均腹腔注射環(huán)磷酰胺(第1天60 mg/kg，后14天10 mg/kg劑量)造模，造模期間每天刮取陰道分泌物制作陰道涂片觀察動情周期，動情周期紊亂或者延長則視為造模成功，造模成功的大鼠納入后續(xù)實驗。實驗組分別連續(xù)28天灌胃高(1.5 g/kg)、中(0.5 g/kg)、低(0.1 g/kg)不同劑量的破壁松花粉，陽性對照組灌胃結(jié)合雌激素溶液(0.075 g/kg)，空白對照組及模型組灌胃生理鹽水。每周記錄大鼠體重變化，末次給藥后大鼠禁食12 h，異氟烷吸入麻醉后腹主動脈取血，于4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取上層血清用于激素和炎癥因子的測定。取出卵巢組織，剔除脂肪后稱重，計算卵巢指數(shù)。稱重后的卵巢一部分用4%多聚甲醛固定用以后續(xù)的病理切片，另一部分采用液氮速凍后置于-80 ℃?zhèn)溆?，用于抗氧化和抗凋亡指?biāo)的測定。本實驗方案經(jīng)江南大學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)實施，審批號為JN.No20201030S1201203[272]，所有動物實驗操作符合江南大學(xué)動物管理與使用委員會的規(guī)定(SYXK2012-0002)。

1.4.2 卵巢指數(shù)計算

卵巢指數(shù)的計算公式如下：

卵巢指數(shù)(g/100 g)=

單個卵巢重量(g)/大鼠體重(g)×100

(1)

1.4.3 卵巢組織病理學(xué)觀察

4%多聚甲醛固定的卵巢使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精伊紅染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織的形態(tài)學(xué)變化，觀察內(nèi)容包括卵巢的始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡及黃體數(shù)的變化及卵巢皮質(zhì)、髓質(zhì)、卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)等病理改變。

1.4.4 血清中激素和炎癥因子水平的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附分析(Elisa)試劑盒測定血清中的E2、P、LH、FSH、AMH、INHB、TNF-α和IL-4等激素和炎癥因子水平，所有實驗操作均按照試劑說明書進行。

1.4.5 顆粒細(xì)胞凋亡水平的檢測

采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒測定卵泡周圍顆粒細(xì)胞的凋亡水平，具體步驟嚴(yán)格按照說明書進行。操作完成后于熒光顯微鏡下拍攝清晰照片，隨機選取5個最高視野用于凋亡細(xì)胞計數(shù)和凋亡指數(shù)計算。

凋亡指數(shù)計算公式如下：

凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%

(2)

1.4.6 卵巢組織中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT的測定

采用商業(yè)化試劑盒測定卵巢組織中SOD、GSH-Px、CAT的活力和T-AOC水平，所有實驗操作嚴(yán)格按照說明書進行。

1.4.7 卵巢組織凋亡因子的表達(dá)

采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法測定卵巢組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved Caspase-3四種凋亡因子的表達(dá)。將冷凍的卵巢在冰上剪切，然后在RIPA裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)中勻漿，靜置30 min。裂解液以14 000 r/min離心10 min，用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液的蛋白濃度。在上清液中加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液，沸水煮10 min，將煮沸的樣品進行電泳分析。使用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉2 h。封閉后PVDF膜用TBST洗滌3次，加入不同的一抗(見表2)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔)室溫孵育1 h。用TBST洗滌3次后，將ECL化學(xué)顯色液均勻滴在PVDF薄膜上，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測發(fā)光強度并用ImageJ進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參計算四種凋亡蛋白的表達(dá)水平。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，所有處理重復(fù)3～6次，采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)分析并作圖。采用Statistix 9(Tallahassee，F(xiàn)L，USA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性分析，P<0.05為具有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 松花粉對卵巢早衰大鼠卵巢指數(shù)的影響

如圖1所示，空白對照組的卵巢指數(shù)最高，模型組的卵巢指數(shù)最低，約為空白組的52%。松花粉高劑量組、中劑量組、低劑量組的卵巢指數(shù)呈梯度下降趨勢，且高劑量組的卵巢指數(shù)與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)，低劑量組的卵巢指數(shù)與模型對照組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，松花粉有增加卵巢指數(shù)的作用。

圖1 松花粉對大鼠卵巢指數(shù)的影響

2.2 松花粉對大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響

卵巢病理切片如圖2所示?？瞻讓φ战M的卵巢內(nèi)可見大量各級卵泡及黃體，未見閉鎖卵泡(見圖2A)。模型組的卵泡數(shù)量明顯減少，幾乎不見正常發(fā)育卵泡，且該組的閉鎖卵泡數(shù)量最多(見圖2B)。陽性對照組各級卵泡數(shù)與空白對照組相近，無閉鎖卵泡(見圖2C)。高劑量松花粉組可見大量成熟卵泡，未見閉鎖卵泡(見圖2D)。中劑量組可見各級卵泡和閉鎖卵泡(見圖2E)。與中劑量組相比，低劑量組有少量正常發(fā)育的卵泡和更多閉鎖卵泡(見圖2F)。此外，低劑量組和模型組的卵巢間質(zhì)有一定程度的纖維化。上述結(jié)果表明，松花粉可以增加各級卵泡的數(shù)量，減少閉鎖卵泡的數(shù)量。

圖2 各組大鼠的卵巢組織病理形態(tài)(100×)

2.3 松花粉對大鼠血清激素的影響

各組大鼠血清中E2、P、LH、FSH、AMH和INHB的水平如圖3所示。模型組E2水平與空白組相比降低了17.7 pg/mL，而P、LH和FSH水平分別增加了5.26 ng/mL、21.67 mIU/mL和275.03 ng/mL(P<0.05)。灌胃陽性藥物后，激素水平與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)。灌胃高、中、低劑量松花粉后，高劑量組6項激素水平與空白對照組均無顯著差異(P>0.05)或顯著(P<0.05)優(yōu)于空白組，中劑量組的各項激素水平與模型組相比均有顯著(P<0.05)改善，低劑量組與模型組相比，F(xiàn)SH和INHB水平顯著(P<0.05)降低了184.27 ng/mL和643.08 pg/mL，AMH顯著提高了1.06 ng/mL(P<0.05)，但E2、P和LH的水平與模型組無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，高、中劑量松花粉可以有效調(diào)節(jié)性激素與促性腺激素水平并提升卵巢的儲備功能。

圖3 松花粉對大鼠血清E2、P、LH、FSH、AMH和INHB水平的影響

2.4 松花粉對大鼠卵巢細(xì)胞凋亡情況的影響

DAPI是一種熒光染料，可以與DNA強力結(jié)合，細(xì)胞被染色后在熒光顯微鏡下觀察有藍(lán)色熒光，可以表征細(xì)胞總數(shù)。TUNEL法采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶將熒光素標(biāo)記到凋亡細(xì)胞中斷裂的染色體DNA產(chǎn)生的大量粘性3′-OH末端，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞有綠色熒光。如圖4中所示，DAPI和TUNEL分別表示細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞結(jié)果，Merge為合并結(jié)果，計數(shù)后可用于計算顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)(見表1)。

圖4 松花粉對大鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡水平影響

如圖4和表1所示，空白對照組中綠色熒光標(biāo)記的凋亡顆粒細(xì)胞很少，對應(yīng)的凋亡指數(shù)約為2.81%。陽性對照組與空白對照組無明顯差異(P>0.05)。模型組閉鎖卵泡周圍可見大量凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)最高，約為27.58%。高劑量組顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)與空白組無顯著差異(P>0.05)且顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)。因此，可以推斷松花粉具有抗顆粒細(xì)胞凋亡作用。

表1 顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)

圖5為采用Western blot檢測四種凋亡蛋白在卵巢中表達(dá)的結(jié)果，其中柱狀圖為四種蛋白條帶以β-actin為內(nèi)參的灰度值結(jié)果。模型組與空白組相比，卵巢Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著增加，Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。經(jīng)松花粉灌胃后，Bcl-2和Bax的比例較模型組顯著提高且具有量效關(guān)系，Caspase-3和Cleaved Caspase-3均有顯著下降，高劑量組17 kDa的Cleaved Caspase-3下降最為顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，松花粉可以調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)且具有一定的量效關(guān)系。

圖5 松花粉對大鼠卵巢凋亡因子表達(dá)的影響

2.5 松花粉對大鼠卵巢抗氧化能力的影響

圖6展示了不同劑量松花粉對大鼠卵巢抗氧化能力的影響。模型組的總抗氧化能力(T-AOC)較空白組顯著(P<0.05)降低，高劑量組T-AOC較模型組提高了70.30%。卵巢中的其他三種抗氧化酶活力也顯示出類似的趨勢。模型組的GSH-Px、SOD和CAT的活力較空白組分別下降了46.61%、40.83%和39.70%，灌胃不同劑量的松花粉后，大鼠卵巢抗氧化酶活力均有一定程度的提升，但僅有高劑量組對三種酶活的提升有顯著性(P<0.05)。結(jié)果表明，松花粉能夠提升POF大鼠卵巢的抗氧化能力，且部分具有一定的量效關(guān)系。

圖6 松花粉對大鼠卵巢T-AOC、GSH-Px、SOD和CAT的影響

2.6 松花粉對大鼠抗炎能力的影響

大鼠血清炎癥因子水平如圖7所示。模型組的兩種炎癥因子均呈現(xiàn)較高濃度，比空白對照組顯著(P<0.05)提高近3倍。灌胃松花粉后，TNF-α和IL-4均顯著下降，且高、中劑量組與空白組無顯著差異(P>0.05)。

圖7 松花粉對大鼠血清TNF-α和IL-4的影響

3 討論與結(jié)論

松花粉為藥食同源原料，其營養(yǎng)成分和功能性質(zhì)均被廣泛研究。有研究表明其具有前列腺保護的功能[10]，且同時具備抗氧化和抗炎的功效[9]，本文通過環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)大鼠POF模型探討松花粉對卵巢的保護功能。

患有POF的大鼠多出現(xiàn)與生殖系統(tǒng)相關(guān)的血清激素水平的變化，如E2和P水平的明顯降低[15]。然而，本文的結(jié)果顯示模型鼠中P的濃度相對空白組有明顯的升高。在POF大鼠中，卵巢囊腫和內(nèi)分泌失調(diào)均可能導(dǎo)致P水平的增加[16]。LH和FSH均由垂體分泌，可調(diào)節(jié)性激素的合成，促進卵泡成熟和黃體生成[17]。CTX可擾亂與卵巢相關(guān)的激素分泌，本研究結(jié)果與其他研究一致[18]。卵巢儲備是指卵巢皮質(zhì)中所含原始卵泡的儲備，AMH和INHB為主要的判斷指標(biāo)。卵巢組織病理學(xué)結(jié)果顯示模型組卵泡數(shù)明顯下降，與AMH降低的結(jié)果一致。INHB是生殖細(xì)胞分泌的一種激素，與生殖能力密切相關(guān)，其主要功能是調(diào)節(jié)FSH的產(chǎn)生[19]。有研究表明，F(xiàn)SH和INHB之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)[19]，而本文的結(jié)果與之相反，原因可能如Carballo等[20]所述，INHB的高水平分泌表明顆粒細(xì)胞中存在腫瘤。本文的結(jié)果表明，經(jīng)松花粉灌胃后，大鼠血清激素分泌趨向正常水平，松花粉有調(diào)節(jié)激素的功能且有量效關(guān)系。

CTX誘導(dǎo)POF的主要機制是誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡[21]，顆粒細(xì)胞的大量凋亡可直接影響卵泡的生長，最終發(fā)展為閉鎖卵泡[22]，進而導(dǎo)致卵巢內(nèi)的卵泡數(shù)量明顯減少甚至耗盡，卵巢儲備能力下降。Caspase-3僅出現(xiàn)在閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中，而不出現(xiàn)在健康卵泡的顆粒細(xì)胞中[23]。Bcl-2相關(guān)的促凋亡和抗凋亡蛋白在Caspase蛋白酶上游的細(xì)胞內(nèi)死亡程序的決策步驟中具有重要作用[24]。本研究中松花粉可以調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)，提高Bcl-2和Bax的比例，降低Cleaved Caspase-3的表達(dá)，從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡，促進卵泡的正常發(fā)育。

卵巢損傷可由自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起，例如活性氧和過氧化氫，氧化應(yīng)激水平增加最終可以導(dǎo)致DNA損傷和顆粒細(xì)胞的凋亡[25]。對于女性生殖系統(tǒng)，抗氧化劑被認(rèn)為是卵巢生理代謝的關(guān)鍵因素，可以有效降低這些自由基的水平，維護卵巢的健康[26]。然而，它們的確切分子機制和作用尚未完全闡明。CAT、SOD和GSH-Px均在性激素調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。本文的結(jié)果也表明，高劑量松花粉可以顯著提高卵巢的抗氧化酶活性，對卵巢功能具有重要意義。

炎癥也是卵巢衰老的可能途徑之一，長期的炎癥可導(dǎo)致卵巢發(fā)生病理變化。腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素均是主要的炎癥因子，且在卵巢功能減退的大鼠中有較高的表達(dá)[28]。有研究認(rèn)為，卵巢的炎性衰老本質(zhì)上與氧化應(yīng)激水平有關(guān)，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)互為因果[29]。本研究結(jié)果也表明POF大鼠血清的TNF-α和IL-4的濃度升高，有較強的炎癥反應(yīng)，而松花粉可以降低炎癥反應(yīng)的程度。

本文證實了松花粉對CTX誘導(dǎo)的POF大鼠的卵巢具有保護作用，如調(diào)節(jié)雌激素E2、P和促性腺激素FSH、LH水平、抗顆粒細(xì)胞凋亡并調(diào)節(jié)凋亡因子Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3，提高抗氧化能力并提高抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT活力和降低炎癥因子TNF-α和IL-4水平的作用，且松花粉的功能與劑量有一定的相關(guān)性。松花粉中含有大量的多糖以及黃酮類化合物，可能與松花粉保護卵巢的功能有關(guān)，尚待進一步研究。本研究為以松花粉為原料開發(fā)具有卵巢保護功能的健康產(chǎn)品具有一定的理論和實際應(yīng)用價值。