中國南海海洋鏈霉菌Streptomyces sp.rssa1的化學成分研究

王 蓉，郭志凱，程 芬，馮全英，詹夏菲

1海南省海洋與漁業(yè)科學院 海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術重點實驗室，?？?571126；2海南熱帶農業(yè)資源研究院 海南省熱帶農業(yè)生物資源保護與利用重點實驗室；3中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 海南省熱帶微生物資源重點實驗室，?？?571101

海洋放線菌是一類具有重要價值的藥用微生物資源，它們能夠產生結構類型多樣的生物活性物質，如大環(huán)內酯類、生物堿類、肽類、醌類等，特別是在抗菌化合物挖掘方面具有巨大潛力。Schinke等[1]曾統(tǒng)計2010年～2015年間海洋細菌來源的抗菌化合物有69%來源于海洋放線菌。由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋放線菌在生理生化特性和遺傳背景特性上與陸生放線菌存在差異，使得從海洋放線菌中尋找活性分子潛力巨大。

本研究組近年來已從南海海洋生物共附生放線菌中發(fā)現(xiàn)了一些具有新穎結構的活性分子[2-4]，最近我們從中國海南西沙群島采集的珊瑚樣品中分離篩選得到的1株具有抗菌活性的海洋鏈霉菌菌株Streptomycessp.rssa1，但其抗菌藥效物質不清楚。為了挖掘該菌株所產生的活性成分，本文首次利用大米固體培養(yǎng)基對它進行了固體發(fā)酵，對其發(fā)酵產物進行系統(tǒng)的化學成分研究，并對其活性進行了篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker DPX 400 MHz和Bruker DRX 600 MHz超導核磁共振波譜儀(德國Bruker 公司，TMS為內標)；Agilent 6210 TOF LC-MS質譜儀(美國Agilent公司)；Waters 1525型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配備分析型色譜柱(Waters XBridge C18，150 mm × 2.1 mm，3.5 μm)和半制備型色譜柱(Waters XBridge C18，250 mm× 10 mm，5 μm)；旋轉蒸發(fā)儀(N1300，上海艾朗儀器有限公司)；ZQZY-CS8V恒溫搖床(上海知楚公司)；分析型薄層層析硅膠板(GF254)和正相層析柱硅膠(45～75 μm)(青島海洋化工)；Sephadex LH-20(瑞典Pharmacia Biotech)和ODS反相硅膠(日本Nacalai Tesque公司)；色譜甲醇(康科德)；實驗中使用的其他試劑均為分析純。

1.2 菌株材料

本文所研究的菌株rssa1是我們從中國南海西沙群島采集的珊瑚樣品中分離純化獲得。通過16S rRNA基因序列測定，并經(jīng)BLAST比對，與菌株Streptomycessp.HBUM206419的16S rRNA序列(GenBank號為MT540570)的相似度為99.93%，結合形態(tài)學特征，將該菌株鑒定為Streptomycessp.。菌株Streptomycessp.rssa1的16S rRNA序列在GenBank中的注冊號為OL314653，并保藏于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所。

1.3 培養(yǎng)基與菌株發(fā)酵

ISP2固體培養(yǎng)基：酵母浸粉 4 g/L，麥芽浸粉10 g/L，葡萄糖4 g/L，瓊脂20 g/L，17.5 g/L人工海鹽，去離子水1L，pH自然；麥芽提取物(ME)液體培養(yǎng)基：20 g/L麥芽提取物，20 g/L蔗糖，1 g/L蛋白胨，17.5 g/L人工海鹽，去離子水1 L，pH值為7.0；大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米30 g，人工半海水(17.5 g/L)45 mL。

海洋鏈霉菌菌株Streptomycessp.rssa1經(jīng)ISP2培養(yǎng)基活化，28 ℃培養(yǎng)5天，之后將活化后的菌株接種至裝有200 mL ME液體培養(yǎng)基的三角瓶(1 000 mL)中，于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)72 h(160 r/min，28 ℃)。取10 mL的ME液體種子液接種到裝有30 g大米的組培瓶中進行發(fā)酵，靜置培養(yǎng)45天(28 ℃)。以上培養(yǎng)基均于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。

1.4 提取與分離純化

大米固體培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵菌株Streptomycessp.rssa1 45天后，加入乙酸乙酯浸提3次，合并提取液，于45 ℃下減壓濃縮得到提取物6 g。對獲得的提取物進行減壓正相硅膠柱層析分離，采用二氯甲烷-甲醇等度洗脫(100∶0、100∶1、100∶2、100∶4、100∶8、100∶16、100∶32、0∶100)，在TLC檢測下合并得到8個組分(Fr.a～Fr.h)。組分Fr.c經(jīng)減壓ODS反相柱層析后，將70%甲醇水部位經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離純化得到化合物3(4 mg)。組分Fr.d經(jīng)ODS反相硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析后，利用半制備HPLC(0～40 min，0 %～70%甲醇，40～42 min，70 %～100%甲醇，42～52 min，100%甲醇，52～53 min，100%～0%甲醇，53～58 min，0%甲醇；波長254 nm，流速為3.0 mL/min)純化得到化合物4(8 mg，tR= 23.5 min)、5(3 mg，tR= 19.6 min)、6(5 mg，tR= 21.6 min)、7(5 mg，tR= 24.1 min)、8(4 mg，tR= 16.1 min)、9(3 mg，tR= 17.4 min)和10(6 mg，tR= 18.5 min)。組分Fr.e經(jīng)ODS反相硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析后，利用半制備HPLC(0～20.0 min，65%甲醇，20.1～40.0 min，70%甲醇)純化得到化合物1(9 mg，tR= 34.6 min)和2(6 mg，tR= 20.3 min)。

1.5 活性篩選

體外抗菌活性測試采用先前報道的濾紙片法測定抑菌圈直徑大小[5]，供試病原細菌為溶藻弧菌(V.alginolyticus)?；衔锖涂敲顾胤謩e用DMSO配成5 mg/mL的樣品溶液備用。測試抗菌活性時，以DMSO為陰性對照，以卡那霉素為樣品對照，選用加人工海鹽的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，人工海鹽25 g/L，瓊脂粉20 g/L，去離子水1 L，pH 7.4)進行細菌培養(yǎng)和測試。用十字交叉法測定抑菌圈直徑，做3次平行重復。采用已報道的方法檢測了化合物對RAW 264.7細胞產生的毒性[6]和環(huán)化核苷酸磷酸二酯酶PDE4水解抑制活性[7]。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物3棕色固體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z321.076 0[M+H]+；分子式為C19H12O5；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.00(1H，s，OH-1)，10.70(1H，s，OH-9)，8.28(1H，br s，H-15)，8.17(1H，br s，H-14)，7.80(1H，br s，H-4)，7.61(1H，br s，H-3)，7.50(1H，br s，H-12)，7.36(1H，br s，H-2)，7.11(1H，br s，H-10)，5.45(1H，t，J=5.6 Hz，19-OH)，4.66(2H，br s，H-19)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：160.9(C-1)，123.6(C-2)，137.6(C-3)，119.4(C-4)，146.6(C-5)，186.5(C-6)，133.6(C-7)，119.7(C-8)，155.6(C-9)，113.7(C-10)，135.6(C-11)，116.8(C-12)，136.5(C-13)，121.7(C-14)，135.5(C-15)，138.6(C-16)，187.8(C-17)，115.5(C-18)，62.8(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故將該化合物鑒定為kanglemycin M。

化合物4黃色固體，溶于氯仿；HR-ESI-MS：m/z284.139 1[M+H]+；分子式為C16H17N3O2；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.25(1H，br s，NH-1)，7.61(1H，d，J=7.7 Hz，H-5)，7.29(1H，d，J=7.7 Hz，H-8)，7.15(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.06(1H，t，J=7.7 Hz，H-6)，7.01(1H，br s，NH-15)，6.82(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，5.44(1H，q，J=7.4 Hz，H-18)，4.26(1H，dd，J=3.8，3.6 Hz，H-11)，3.56(1H，dd，J=14.8，2.8 Hz，H-10a)，3.26(1H，dd，J=14.8，4.8 Hz，H-10b)，3.09(3H，s，H-17)，0.88(3H，d，J=7.4 Hz，H-19)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：124.8(C-2)，107.9(C-3)，127.5(C-4)，118.7(C-5)，119.8(C-6)，122.3(C-7)，110.9(C-8)，136.2(C-9)，27.7(C-10)，63.3(C-11)，166.5(C-13)，126.2(C-14)，160.3(C-16)，32.9(C-17)，112.2(C-18)，9.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，故將該化合物鑒定為二酮哌嗪類化合物tryptophandehydrobutyrine diketopiperazine。

化合物5白色晶體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z175.086 9[M+H]+；分子式為C10H10N2O；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.85(1H，br s，NH-1)，7.55(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，7.34(1H，t，J=7.8 Hz，H-8)，7.28(1H，br s，NH)，7.19(1H，d，J=1.4 Hz，H-2)，7.07(1H，t，J=7.8 Hz，H-7)，7.00(1H，t，J=7.8 Hz，H-6)，6.82(1H，br s，NH)，3.47(2H，s，H-10)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：124.2(C-2)，109.5(C-3)，127.7(C-4)，121.4(C-5)，111.7(C-6)，118.7(C-7)，119.1(C-8)，136.6(C-9)，33.0(C-10)，173.4(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致，故將該化合物鑒定為3-吲哚乙酰胺。

化合物7無色片狀晶體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z137.059 7[M+H]+；分子式為C8H8O2；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.30(1H，br s，COOH)，7.31(2H，d，J=7.7 Hz，H-3，H-5)，7.26(2H，d，J=7.7 Hz，H-2，H-6)，7.24(1H，t，J=7.0 Hz，H-4)，3.56(2H，s，H-7)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：135.6(C-1)，129.8(C-2，C-6)，128.7(C-3，C-5)，127.0(C-4)，41.3(C-7)，173.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致，故將該化合物鑒定為苯乙酸。

化合物8黃色油狀物，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z180.101 7[M+H]+；分子式為C10H13NO2；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.03(2H，d，J=8.2 Hz，H-2，H-6)，6.74(2H，d，J=8.2 Hz，H-3，H-5)，3.34(2H，t，J=7.4 Hz，H-8)，2.69(2H，t，J=7.4 Hz，H-7)，1.92(3H，s，H-10)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：155.5(C-1)，114.9(C-2，C-6)，129.4(C-3，C-5)，129.9(C-4)，34.3(C-7)，41.1(C-8)，171.9(C-9)，21.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致，故將該化合物鑒定為N-乙?；野贰?/p>

化合物9無色片狀晶體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z122.060 1[M+H]+；分子式為C7H7NO；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.97(1H，br s，NH)，7.87(2H，dd，J=7.7，1.4 Hz，H-2，H-6)，7.52(1H，t，J=7.7 Hz，H-4)，7.45(2H，t，J=7.7 Hz，H-3，H-5)，7.35(1H，br s，NH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：134.7(C-1)，127.9(C-2，C-6)，128.7(C-3，C-5)，131.7(C-4)，168.4(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致，故將該化合物鑒定為苯甲酰胺。

化合物10白色晶體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z136.075 6[M+H]+；分子式為C8H9NO；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.46(1H，br s，NH2)，7.30(2H，d，J=7.2 Hz，H-3，H-5)，7.26(2H，d，J=7.2 Hz，H-2，H-6)，7.22(1H，t，J=7.2 Hz，H-4)，6.87(1H，br s，NH2)，3.37(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：137.0(C-1)，129.5(C-2，C-6)，128.6(C-3，C-5)，126.7(C-4)，42.6(C-7)，172.7(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17,18]報道一致，故將該化合物鑒定為苯乙酰胺。

化合物1～10結構見圖1。

圖1 化合物1～10的化學結構

2.2 活性測試結果

抗菌活性實驗顯示，化合物4對溶藻弧菌具有微弱的抑制活性，其抑菌圈直徑為8.33±0.67 mm，顯著弱于陽性對照卡那霉素的抑制效果(抑菌圈直徑為26.67±0.33 mm)。針對巨噬細胞RAW 264.7的毒性篩選結果顯示，化合物3在10 μmol/L濃度下，RAW 264.7細胞的存活率為(18.97±0.31)%，表明它對RAW 264.7具有細胞毒性?；衔?對環(huán)化核苷酸磷酸二酯酶PDE4的水解抑制活性篩選結果顯示，它在5 μmol/L的測試濃度下無抑制活性，而陽性對照rolipram的水解抑制率為52.02%。

3 討論與結論

放線菌是一類具有重要價值的藥源微生物，目前發(fā)現(xiàn)的天然抗生素中近三分之二源于放線菌中，尤其是鏈霉菌。本文從珊瑚來源的鏈霉菌Streptomycessp.rssa1的代謝產物中分離鑒定出10個化合物，其中化合物1和2分別為四烯大環(huán)內酯類化合物四霉素A和四霉素B[8,9]，化合物3為苯并萘醌類化合物kanglemycin M[10]，活性篩選發(fā)現(xiàn)它對巨噬細胞RAW 264.7具有細胞毒活性，進一步豐富了我國海洋放線菌活性天然產物庫?；衔?為一種二酮哌嗪類化合物tryptophandehydrobutyrine diketopiperazine。Li等[11]曾報道該化合物具有殺線蟲活性，它對線蟲(Panagrellusredivivus)48 h的致死率為40%，本文首次從海洋鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)具有殺線蟲活性的化合物4，預示著該菌可能在作物根結線蟲病害防治中具有價值，并且發(fā)現(xiàn)它對溶藻弧菌具有弱抑制活性，為防治水產弧菌病害的藥物研發(fā)提供線索?；衔?～10均為常見的吲哚類或含苯類簡單化合物，其中Jin等[13]從植物豬毛菜中首次發(fā)現(xiàn)的化合物7具有較強的α淀粉酶抑制活性，在濃度0.556 mg/mL時的抑制率為44%。

多烯大環(huán)內酯類物質是一類高效廣譜抗真菌抗生素，如納他霉素能夠抑制霉菌和酵母菌，并因具有良好的理化穩(wěn)定性而被作為天然食品防腐劑和抗菌添加劑[8,9]。本文分離發(fā)現(xiàn)的化合物1和2分別被鑒定為四烯大環(huán)內酯類抗生素四霉素A和B，其結構上均有一個25個碳原子組成內酯環(huán)骨架，環(huán)上有4個共軛雙鍵和多個羥基，并在15號位羥基通過糖苷鍵連接1個氨基糖。目前發(fā)現(xiàn)的四霉素產生菌均為鏈霉菌放線菌，最早是由Dornberger等[19,20]從鏈霉菌Streptomycesnoursei中發(fā)現(xiàn)，并且它們對苜蓿根腐病菌、稻瘟病菌等農業(yè)病原真菌具有較強抑制作用。然而，由于四霉素A和B的化學結構在陽光下不穩(wěn)定，它們對紫外線較為敏感，因而限制了它們在農業(yè)生產上的直接應用[9]。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)四霉素A和B在較低濃度下對黃曲霉菌具有較好的殺菌效果，最低殺菌濃度分別為3.13和12.56 μg/mL。由于多烯大環(huán)內酯類化合物對哺乳動物毒性低且無副作用[21]，具有成為糧食和飼料防霉劑的潛力。本文首次從南海珊瑚來源的鏈霉菌菌株rssa1中發(fā)現(xiàn)了具有強效抗真菌活性的四烯大環(huán)內酯類化合物四霉素A和四霉素B，由于許多研究表明它們在醫(yī)藥和農業(yè)病害防治領域具有良好的應用前景，因此該菌可能作為開發(fā)高效、低毒藥物和綠色生防菌劑的一種重要菌種資源，該發(fā)現(xiàn)也為從我國熱帶海洋生物中尋找具有藥用和農用價值的放線菌資源提供重要線索。