藜蒿總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

肖愷靈 張媛媛 齊致源 付家敏 王琤韡

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

藜蒿(Artemisia selengensis Turcz.)屬桔梗目菊科，別名蘆蒿、柳葉蒿、蔞蒿、水艾、水蒿等，為多年生草本植物，植株具清香氣味[1]。藜蒿作為一種特色植物資源，遍生于江西省鄱陽湖附近區(qū)域[2]。民間多食其嫩莖葉，全株亦可入藥，安全無副作用，其藥用價(jià)值在古本草書中已有記載，明代李時(shí)珍的《本草綱目》中寫道：“藜蒿味平甘，主五臟邪氣，風(fēng)寒濕痹，補(bǔ)中益氣，長(zhǎng)毛發(fā)令黑，療心懸，少食長(zhǎng)饑；久服輕身耳目聰明不老”[3]。研究表明，藜蒿富含黃酮類、多酚類等活性成分，能夠清除多種自由基，具有良好的抗氧化活性[3-5]。因此藜蒿具有清火消炎以及治療寒冷腹痛、急性肝炎等功效，也被發(fā)現(xiàn)可用于治療黃膽型或無黃膽型肝炎[7]。

總黃酮（Flavonoids）是一類黃酮類化合物，屬植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、降血壓、抗氧化及促進(jìn)新陳代謝等功能[7]。現(xiàn)代研究表明，總黃酮因酚羥基上的氫原子與過氧自由基結(jié)合生成黃酮自由基，進(jìn)而與其他自由基反應(yīng)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[8]，因此總黃酮能夠提高機(jī)體抗氧化及清除自由基的能力，且無毒無害，可作為綠色抗氧化劑。

目前，關(guān)于藜蒿總黃酮的抗氧化等研究較少，對(duì)于藜蒿這種特色植物的開發(fā)也處于起步階段。相比于新興的微波輔助萃取法和超臨界流體萃取法，溶劑回流萃取法作為傳統(tǒng)的醇提法雖然耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、步驟較多，但采用的乙醇溶劑具有低毒性、價(jià)格低廉、使用簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)方面提取藜蒿總黃酮時(shí)具有更大的優(yōu)勢(shì)。因此本實(shí)驗(yàn)采用溶劑回流萃取法，優(yōu)化藜蒿提取工藝條件，為大規(guī)模提取藜蒿總黃酮提供參考依據(jù)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，提高總黃酮得率，以DPPH 自由基清除率、OH自由基清除率和還原能力為指標(biāo)，對(duì)藜蒿總黃酮的體外抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究為藜蒿資源有效開發(fā)提供了合理的數(shù)據(jù)，為藜蒿總黃酮提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供了具體的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

整株野生藜蒿（采摘自江西省鄱陽湖附近）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；無水乙醇（北京化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、AlCl3·6H2O、HCl、NaOH（西隴科學(xué)股份有限公司）；DPPH（上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司）。以上試劑均為分析純。

ES2000 型電子天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；DHG-9015A 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；722N 可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；RE-522AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KL05A 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁0.010 g，置于50 mL 容量瓶中，以60%乙醇溶解定容至刻度，取25 mL 定容后的溶液用蒸餾水稀釋至50 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液2、4、6、8、10 mL 分別加入5 支試管中，向每支試管中加入5 mL 30%乙醇溶液、0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻放置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，最后加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，蒸餾水稀釋至25 mL，放置25 min。在可見分光光度計(jì)上設(shè)定波長(zhǎng)510 nm，測(cè)定各試管中溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3.2 藜蒿總黃酮提取工藝

取整株藜蒿在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)60 ℃下烘干至恒重，超微粉碎后過80 目篩得到樣品粉末。準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理后的藜蒿樣品粉末1.000 g 置于25 mL圓底燒瓶中，加入一定體積的70%乙醇溶液浸泡1 h 后，放入一定溫度恒溫水浴鍋中回流提取一定時(shí)間，得到的提取液用濾紙過濾定容至25 mL。在見分光光度計(jì)上設(shè)定波長(zhǎng)510 nm，測(cè)定試管中溶液的吸光度。

1.3.3 藜蒿總黃酮得率的計(jì)算

利用線性回歸方程計(jì)算藜蒿中總黃酮得率：

式中：C 為樣品中黃酮的濃度（g/L）；V 為樣品提取液的體積（mL）；n 為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；m 為藜蒿樣品干粉的質(zhì)量（g）?？傸S酮得率r 的單位為mg/g。

1.3.4 藜蒿總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在藜蒿粉末質(zhì)量（1.000 g）不變的情況下，設(shè)置提取溫度、提取時(shí)間、液固比三個(gè)變量，研究其對(duì)藜蒿總黃酮提取率的影響。設(shè)液固比15 mL/g、提取時(shí)間1.5 h 為不變量，研究分析5 個(gè)不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對(duì)藜蒿總黃酮提取率的影響；設(shè)液固比20 mL/g、提取溫度70 ℃為不變量，研究分析5 個(gè)不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對(duì)藜蒿總黃酮提取率的影響；設(shè)提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h 為不變量，研究分析5 個(gè)不同液固比（10、15、20、25、30 mL/g）對(duì)藜蒿總黃酮提取率的影響。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)，確定影響藜蒿總黃酮得率的主要因素和各因素參數(shù)范圍，選擇對(duì)得率影響較大的提取溫度、液固比和提取時(shí)間3 個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（33）。正交試驗(yàn)因素水平見表1。通過正交試驗(yàn)確定藜蒿總黃酮提取的最佳工藝組合。

表1 藜蒿總黃酮醇提法正交試驗(yàn)因素水平

1.3.5 體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.5.1 總還原能力的測(cè)定

取上述優(yōu)化條件下的提取物，減壓濃縮成稠膏，使用70%的乙醇溶解并稀釋，得濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 g/L 的黃酮溶液，使用相應(yīng)濃度的VC 做對(duì)照試驗(yàn)。參照李冬梅等[10]的方法，并做相應(yīng)修改。取1%的鐵氰化鉀2.5 mL 與0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液0.2 mL，加入待測(cè)樣品溶液，50 ℃恒溫放置30 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，離心取上清液1 mL，加入1 mL 的0.1% Fe Cl3、4 mL 蒸餾水混勻，靜置10 min，于700 nm 處測(cè)吸光度。

還原能力計(jì)算公式為 還原能力=A1-A2（2）其中，A1為樣品組吸光度；A2為樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替FeCl3溶液）。1.3.5.2 清除OH 自由基能力的測(cè)定

參照田建華等[11]的方法，并做相應(yīng)修改。取2 mmol/L FeSO4溶液5 mL，6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液15 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液5 mL，搖勻混合。在37 ℃恒溫水浴15 min，以蒸餾水為參照，于517 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率：

OH 自由基清除率=(A0-A1)/A0×100% （3）式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.3.5.3 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

參照董玉瑋等[12]的方法，并做相應(yīng)調(diào)整。取不同濃度提取液3 mL，精確取0.4 mL/mg 的DPPH-乙醇溶液3 mL，試管暗置30 min，4000 r/min 離心10 min，使用無水乙醇做對(duì)照品試驗(yàn)。取上清液于517 nm 處測(cè)吸光度，并計(jì)算清除率：

DPPH 自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

（4）其中，A0為3 mL 無水乙醇+3 mL DPPH 溶液的吸光度；A1為3 mL 樣品溶液+3 mL DPPH 溶液的吸光度；A2為3 mL 樣品溶液+3 mL 無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1。求出回歸方程：y=2.177x+0.0042，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，說明蘆丁濃度與吸光度呈線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 液固比對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響

設(shè)置提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，以液固比為變量考察其對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可得出，隨著液固比增大，總黃酮得率在10、15、20 mL/g 范圍內(nèi)增高，在液固比為20 mL/g 時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)液固比超過20 mL/g 時(shí)，總黃酮得率下降。原因可能是液固比較低時(shí)乙醇溶劑不足導(dǎo)致藜蒿黃酮提取不完全，而液固比較高時(shí)，乙醇溶劑過多影響藜蒿黃酮提取率。因此，20 mL/g 的液固比是藜蒿黃酮提取的最佳參數(shù)。

圖2 液固比對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響

設(shè)置提取時(shí)間1.5 h、液固比15 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在提取溫度50、60、70、80、90 ℃范圍內(nèi)考察其對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，總黃酮得率隨提取溫度的變化而變化，在提取溫度為80 ℃時(shí)達(dá)到得率的最大值，此時(shí)提取溫度再升高，黃酮得率反而下降。原因可能是提取溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)更加劇烈，增大了黃酮提取率，但提取溫度過高，破壞了分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致藜蒿總黃酮提取率下降。所以，80 ℃的提取溫度是藜蒿黃酮提取的最佳條件。

圖3 提取溫度對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響

設(shè)置提取溫度70 ℃、液固比15 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在0.5-2.5 h 范圍內(nèi)考察提取時(shí)間對(duì)藜蒿黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，在一定范圍內(nèi)藜蒿總黃酮得率隨提取時(shí)間而變化，并在提取時(shí)間為1.5 時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是提取時(shí)間過短，藜蒿黃酮溶出過少導(dǎo)致總黃酮得率低，而提取時(shí)間過長(zhǎng)，藜蒿中的總黃酮會(huì)發(fā)生熱分解損失，藜蒿黃酮提取率下降。因此，1.5 h 的提取時(shí)間是藜蒿黃酮提取的最佳條件。

圖4 提取時(shí)間對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響

各因素對(duì)藜蒿總黃酮得率的影響并非單一線性，實(shí)際上總黃酮得率受到提取溫度、提取時(shí)間、液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)因素的交叉影響，而乙醇體積分?jǐn)?shù)因素對(duì)藜蒿總黃酮得率影響較小，因此根據(jù)單因素考察試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間、液固比三個(gè)因素設(shè)置正交試驗(yàn)的因素水平，對(duì)藜蒿總黃酮的提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析如表2、表3 所示。由表3 可知，各因素對(duì)提取藜蒿總黃酮的影響不同，在本研究中提取溫度影響最大，其次是液固比，最后是提取時(shí)間。藜蒿總黃酮的最佳提取參數(shù)組合為A3B2C2，即最佳提取工藝條件是提取溫度80 ℃、液固比20 mL/g、提取時(shí)間1.5 h。

表2 藜蒿總黃酮醇提法正交試驗(yàn)結(jié)果

用正交設(shè)計(jì)助手軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，P＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異，P＜0.01 則認(rèn)為有極顯著性差異。由表3 可知，因素A 在P＜0.01水平上有極顯著性差異，因素B 和因素C 在P＜0.05 水平上有顯著性差異。如表4，為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，考察預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在優(yōu)化的工藝參數(shù)下（提取溫度80 ℃、液固比20 mL/g、提取時(shí)間1.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%），進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得藜蒿總黃酮平均得率為38.32 mg/g。

表3 藜蒿總黃酮醇提法正交實(shí)驗(yàn)方差分析

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 藜蒿總黃酮總還原能力

測(cè)定藜蒿總黃酮和VC 的總還原能力結(jié)果見圖5。隨著黃酮濃度和VC 濃度的增加，還原能力都出現(xiàn)較為明顯的上升，當(dāng)VC 的濃度達(dá)到0.8 g/L 時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，為1.040；而總黃酮的濃度為0.8 g/L 時(shí)，吸光度為0.971。藜蒿總黃酮總還原能力隨著總黃酮濃度的增加而提高，與同濃度VC 的還原能力相近。由此證明了藜蒿總黃酮具有一定的還原能力。

圖5 不同濃度的藜蒿總黃酮總還原能力

2.4.2 藜蒿總黃酮對(duì)OH 自由基清除能力

由圖6 可知，在總黃酮濃度為0.1-0.8 g/L 范圍內(nèi)時(shí)，藜蒿黃酮對(duì)OH 自由基有一定的清除作用，清除能力隨著黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，且略高于VC 的清除能力，當(dāng)濃度達(dá)到0.8 g/L 時(shí)，黃酮對(duì)OH 自由基的清除率為91.12%，VC 對(duì)OH 自由基的清除率為90.68%，二者清除能力較為接近。結(jié)果表明藜蒿總黃酮具有良好的清除OH 自由基的能力。

圖6 藜蒿總黃酮對(duì)OH 自由基的清除率

2.4.3 藜蒿總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除能力

圖7 為藜蒿黃酮和VC 清除DPPH 自由基能力曲線。由圖7 可知，藜蒿黃酮在濃度0.1-0.8 g/L 范圍內(nèi)，對(duì)DPPH 自由基的清除能力隨著濃度的增加有所提高，在0.1-0.3 g/L 濃度范圍內(nèi)，曲線較平緩，在0.3-0.7 g/L 濃度范圍內(nèi)，清除能力增加較快，在濃度達(dá)到0.8 g/L 時(shí)，黃酮對(duì)DPPH自由基的的清除率為77.32%，VC 對(duì)DPPH 自由基的的清除率為86.44%，黃酮的清除能力略低于VC。說明藜蒿總黃酮有一定的清除DPPH 自由基的能力。

圖7 藜蒿總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中通過單因素的考察與正交試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)提取溫度對(duì)藜蒿總黃酮的提取影響較大。乙醇的沸點(diǎn)為78.31 ℃，因此采用乙醇為溶劑的萃取法的適宜溫度應(yīng)在乙醇的沸點(diǎn)左右。本實(shí)驗(yàn)得出最佳提取溫度為80 ℃，這與其他植物總黃酮提取溫度相近[9-11]。楊凌君等[12]同樣采用醇提法研究了藜蒿葉中總黃酮的提取工藝優(yōu)化，得到的最佳工藝參數(shù)為液固比15 mL/g、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h，與本研究的結(jié)果相接近。此外，抗氧化活性結(jié)果顯示：藜蒿整株提取的總黃酮對(duì)DPPH、OH 自由基具有良好的清除能力，并且具有一定的總還原能力，謝星等[13]和Zhang 等[14]的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

藜蒿為藥食兩用新資源，富含多種對(duì)人體健康有利的營(yíng)養(yǎng)活性成分，有望用作天然綠色的抗氧化劑。因此，有必要進(jìn)一步研究其抗氧化的作用機(jī)制以及提取工藝，為藜蒿的開發(fā)利用提供依據(jù)。