固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮的含量

楊開(kāi)智 梁 丹 黃生林

（常德市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 常德 415000）

甲基睪酮（MET）是一種人工合成的代謝類(lèi)固醇，屬于蛋白同化激素，具有增強(qiáng)雄性體性和蛋白同化雙重作用，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可以提高產(chǎn)量和控制性別[1-2]。然而其在人體的極少殘留也會(huì)造成人內(nèi)分泌紊亂、性早熟、胎體中毒、致畸致癌等嚴(yán)重后果[3]。因此，甲基睪酮在水產(chǎn)品中的殘留引起了人們的重視，世界上大多數(shù)國(guó)家禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和治療中使用甲基睪酮。2001 年我國(guó)農(nóng)業(yè)部實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5070—2001《無(wú)公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中，將甲基睪酮列為禁用藥物。2003 年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235 號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定甲基睪酮為禁用獸藥。

目前甲基睪酮的檢測(cè)方法是高效液相色譜法[4-5]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法提高了對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是由于儀器昂貴，檢測(cè)成本高，不易推廣。高效液相色譜法在使用上方便、快捷，靈敏度能達(dá)到要求，因此本文對(duì)前處理過(guò)程和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，利用紫外檢測(cè)器對(duì)甲基睪酮進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法縮短了前處理時(shí)間，靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基睪酮的快速檢測(cè)，在提高實(shí)驗(yàn)樣品回收率的同時(shí)，也提高了工作效率。這對(duì)加強(qiáng)MET 的檢測(cè)、保障人們的飲食安全和身體健康具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)

Waters Alliance 2695 高效液相色譜儀，配備2489 紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠）；精密電子天平（梅特勒-托利多稱(chēng)重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）；24 孔氮吹儀（美國(guó)Organmation 公司）；微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司，純度≥98%）；乙酸乙酯、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；正己烷（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；固相萃取小柱（美國(guó)Waters 公司）；實(shí)驗(yàn)室用水均為屈臣氏蒸餾水。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱(chēng)取適量的甲基睪酮，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-18 ℃避光保存，有效期6 個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取0.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50 mL 容量瓶中，甲醇定容，甲基睪酮濃度為1 μg/mL。-18 ℃避光保存，有效期3個(gè)月。

稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，向離心管中加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，于超聲波振蕩器中常溫超聲10 min，6000 r/min 離心8 min，取上清液置于旋蒸瓶中，重復(fù)操作一次，合并提取液。將提取液于40 ℃水浴中減壓蒸發(fā)至干。加入2 mL 甲醇、1 mL 水，洗滌瓶壁后混勻，繼續(xù)加入4 mL正己烷，渦旋混勻后將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，重復(fù)操作一次。

將離心管放入離心機(jī)于5000 r/min 離心5 min，棄去上層正己烷，將下層甲醇水溶液過(guò)親水-親脂平衡（HLB）柱(使用前用4 mL 甲醇和4 mL水活化)，20% 甲醇水溶液淋洗后真空抽干，加入4 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃水浴下氮吹至干，加入1 mL 流動(dòng)相充分溶解，經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

色譜柱為X-Bridgr C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為甲醇，B 為水；A、B 流動(dòng)相比例為70∶30，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2 結(jié)果與討論

比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及乙醚四種常用的水產(chǎn)品提取溶劑。四種提取溶劑均能有效地提取水產(chǎn)品中的甲基睪酮。但是乙醚揮發(fā)性強(qiáng)，對(duì)環(huán)境危害較大；甲醇和乙腈易溶于水，水產(chǎn)品基質(zhì)含有較多水分，在旋蒸過(guò)程中帶入不易蒸干；乙酸乙酯具有不易揮發(fā)、毒性較小、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。因此本文采用乙酸乙酯作為水產(chǎn)品中甲基睪酮的提取溶劑。

甲基睪酮屬蛋白同化激素，脂溶性強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，有效去除雜質(zhì)是準(zhǔn)確定量和實(shí)現(xiàn)低檢出限的關(guān)鍵。而水產(chǎn)品蛋白含量高，干擾物質(zhì)較多，必須采用有效的方法去除雜質(zhì)。本文采用正己烷去脂和固相萃取柱萃取相結(jié)合的凈化方式，更好地去除雜質(zhì)干擾，保證目標(biāo)物的回收率，進(jìn)一步降低目標(biāo)物的檢出限。本文比較了四種不同的固相萃取柱（C18 柱、HLB 柱、中性氧化鋁柱以及MAX 柱)對(duì)甲基睪酮的凈化效果，其回收率的結(jié)果見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)選擇利用親水親脂的HLB柱，步驟簡(jiǎn)單，凈化效果好。

圖1 不同固相萃取柱的目標(biāo)物回收率

選擇合適的流動(dòng)相使目標(biāo)物能較好分離，不妨礙檢測(cè)器的正常工作在波長(zhǎng)范圍無(wú)吸收并且保護(hù)色譜柱，保證合適的柱壓。甲基睪酮藥物的兩種常用的流動(dòng)相有乙腈- 水和甲醇- 水兩種選擇，本文比較上述兩種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇-水溶液效果最好，甲基睪酮的分離效果最好。當(dāng)流速為1.0 mL/min 時(shí)，從90%比例甲醇逐步降低到70%比例甲醇時(shí)甲基睪酮的分離度高，峰形好，出峰快。

圖2 甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)色譜峰

用甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取20 μL 進(jìn)入高效液相色譜儀中。按照其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可得甲基睪酮色譜峰面積在濃度0.02-1.0 mg/L 范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=73.4X+1.76，相關(guān)系數(shù)大于0.9994。將6.0 μg/kg 的加標(biāo)樣品平行測(cè)定6 次，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的甲基睪酮濃度確定該方法定量限為6.0 μg/kg。

選用草魚(yú)、中華鱉、對(duì)蝦三種不同的空白水產(chǎn)品，按照上述“1.3 樣品前處理”進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，分別添加6、30、60 μg/kg 三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平設(shè)6 個(gè)平行，按1.2 節(jié)所述條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，可得到回收率為71.5%-89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%-8.03%，具體結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明能取得良好的回收效果。

表1 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

本文通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了利用液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康姆椒?。樣品采用乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱凈化。該方法簡(jiǎn)單、快速，具有很好的適用性和可操作性，譜圖無(wú)干擾，提高了方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法可全面、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)水產(chǎn)品中甲基睪酮藥物殘留，對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行有效監(jiān)控，為政府加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品違規(guī)使用獸藥問(wèn)題的監(jiān)管提供技術(shù)支撐。