國產(chǎn)經(jīng)導(dǎo)管人工主動脈自膨脹瓣膜置入術(shù)后2年組織學(xué)分析

劉巍 鄺大軍 楊劍 楊立 劉兆剛 許莎莎 雷洋 王云兵

隨著人口老齡化和生活水平的改變，退行性瓣膜疾病的患病率大幅上升。外科瓣膜置換術(shù)或修補術(shù)是目前瓣膜病患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而，在過去的十多年里，經(jīng)導(dǎo)管技術(shù)迅速發(fā)展。經(jīng)導(dǎo)管主動脈瓣置換術(shù)（transcatheter aortic valve replacement，TAVR）早期應(yīng)用于外科風(fēng)險極高的重度癥狀性主動脈瓣狹窄患者，目前，手術(shù)適應(yīng)證逐漸向手術(shù)中?；虻臀；颊哌^渡。既往研究顯示無論是球囊擴張還是自膨脹瓣膜，在臨床預(yù)后方面均不劣于甚至優(yōu)于外科瓣膜［1］。但由于生物瓣膜面臨著早期衰敗的風(fēng)險，限制了經(jīng)皮導(dǎo)管手術(shù)在更為年輕的患者中的應(yīng)用。所以也迫切地需要對置入瓣膜發(fā)生的組織學(xué)變化進行分析，以促進產(chǎn)品材料和性能的改進?，F(xiàn)有經(jīng)導(dǎo)管人工主動脈瓣膜材料基礎(chǔ)研究報道主要為體外實驗、大動物實驗以及TAVR試驗的數(shù)據(jù)，少有TAVR一段時間后的數(shù)據(jù)報道。本研究由北京積水潭醫(yī)院（北京大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院）對TAVR術(shù)后2年后取出的國產(chǎn)經(jīng)導(dǎo)管人工主動脈瓣膜Venus A valve進行外觀、鈣化情況、微觀結(jié)構(gòu)、組織切片以及免疫組化的分析和評價，有助于進一步了解國產(chǎn)瓣膜產(chǎn)品置入人體后的性能變化。

1 臨床資料

1.1 研究對象

患者 男，58歲。于2018年5月11日因主動脈瓣狹窄伴關(guān)閉不全，主動脈瓣二瓣畸形，重度通氣功能障礙，順利置入26 mm Venus A valve瓣膜。術(shù)后因房室傳導(dǎo)阻滯行永久起搏器植入術(shù)。于2020年5月7日因胸悶、氣短、心悸1個月，發(fā)熱3 d再次入住空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，診斷：感染性心內(nèi)膜炎，TAVR術(shù)后，主動脈瓣瓣周漏， 美國紐約心臟病協(xié)會（New York Heart Association，NYHA）心功能分級Ⅲ級，心臟起搏器植入術(shù)后。行體外循環(huán)下取出人工瓣膜，清除贅生物、切除病變主動脈瓣，將機械瓣縫合至主動脈瓣瓣環(huán)上。

1.2 外觀觀察

通過光學(xué)顯微鏡對樣品進行外觀檢查，瓣膜的支架無變形、破損，縫線無斷裂。圖1為瓣膜在光學(xué)顯微鏡下拍攝的圖片，從圖中可以看出瓣膜支架大面積被人體組織覆蓋。在瓣膜流出端，組織覆蓋從瓣膜護耳處往上蔓延，并在瓣葉根部附近覆蓋。在瓣膜流入端，裙體也基本被組織覆蓋。瓣葉上下表面光滑，無明顯血栓形成、無撕裂，瓣葉關(guān)閉功能正常，依舊保持柔軟。

圖1 光學(xué)顯微鏡下瓣膜外觀

1.3 厚度測試

將樣品與金屬支架直接分離，再將瓣葉和裙體剪下（圖2），用測厚儀測量其厚度。瓣葉和裙體的厚度見表1。正常瓣葉的厚度在0.3 mm左右，裙體的厚度在0.2 mm左右。表1中瓣葉和裙體的厚度已經(jīng)超過了瓣膜出廠時瓣葉和裙體的厚度，說明在置入人體2年后，瓣葉和裙體表面有一層物質(zhì)生成，且裙體增厚幅度要大于瓣葉的增厚幅度，這與外觀圖結(jié)果一致。

表1 瓣葉和裙體厚度

圖2 瓣膜拆解

1.4 X線觀察

測試條件為：Xray_voltage_kV=55.000000，Xray_current_mA=0.170000。設(shè)置好儀器測試條件后，拍片觀察樣品的鈣化情況。用X線來分析瓣膜整體鈣化情況。從圖3可知，瓣膜整體基本沒有鈣化，只在由下往上第3個菱形格交叉附近有一處鈣化點（紅色箭頭所示），圖3C顯示瓣膜中間瓣葉處沒有鈣化點。

圖3 瓣膜X 線鈣化分析（紅色箭頭所示）

1.5 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

測試條件為樣品在5-k V下，放大倍數(shù)由低往高觀察。樣品冷凍切片（-30℃）。樣品分別逐級在50%、70%、90%、100%乙醇溶液中浸泡10 min，其中在100%乙醇溶液中浸泡2次；超臨界干燥4 h；將干燥后的樣品噴金；以SEM觀察。將剪下的瓣葉按圖4中箭頭方向觀察樣品的橫截面。圖5是三個區(qū)域中比較有代表性的圖片。圖5A是豬心包膜的截面圖，可以看出膠原纖維排列緊密，有明顯的纖維層與纖維束。圖5B中左下方纖維和右上方纖維在排列上有明顯差異，右上方為心包組織，纖維排列緊致，纖維方向一致性較好，纖維間無明顯撕裂、斷裂情況。瓣膜置入人體2年，瓣葉纖維結(jié)構(gòu)無顯著變化。左下方為心包膜增生組織，纖維方向雜亂，結(jié)構(gòu)松散。對左下方纖維和右上方纖維分別放大2000倍進行觀察（圖5C～D），可以發(fā)現(xiàn)圖5D的截面空洞多，結(jié)構(gòu)松散，沒有層次感；圖5C的橫截面纖維排列相對緊密，能看到纖維束，有層次感，這與圖5B中展現(xiàn)的形貌是一致的。本研究組認為瓣葉表面纖維化，使得瓣葉增厚，其表面的纖維結(jié)構(gòu)松散。

圖4 瓣葉橫截面方向

圖5 樣品掃描電鏡圖

1.6 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

將樣 品用酒精梯度脫水后，用二甲苯透明處理，再將處理后的樣品用石蠟包埋，用切片機切成4 μm的石蠟帶，最后將樣品進行烤片處理。將烘烤后的組織切片用二甲苯進行脫蠟，脫蠟后的組織切片用梯度酒精和蒸餾水處理，用HE染色，再用酒精和二甲苯處理后封片。用顯微鏡觀察HE染色組織切片。

將樣品按圖6所示分成3個區(qū)域，所有切片按橫向切，染色后對3個區(qū)域進行觀察。從樣品外觀圖就可以看到流出端瓣葉根部及護耳處有血管翳產(chǎn)生。圖7是圖6頂部區(qū)域的HE染色圖。圖7B、C是圖7A的黑色矩形區(qū)域放大圖。圖7A的切片整體染色結(jié)果與圖6頂部區(qū)域的外觀保持一致。瓣葉開閉活動區(qū)域無明顯增生，瓣葉根部及護耳處增生顯著。從圖7C中可知，增生的血管翳厚度可達約300 μm，主要分布在瓣膜流出端，也有少量分布于瓣膜流入端。

圖6 瓣葉分區(qū)

圖7 樣品蘇木素-伊紅染色

1.7 V on Kossa染色

將樣品用酒精梯度脫水后，用二甲苯透明處理，再將處理后的樣品用石蠟包埋，用切片機切成4 μm的石蠟帶，最后將樣品進行烤片處理。將烘烤后的組織切片用二甲苯進行脫蠟，脫蠟后的組織切片用梯度酒精和蒸餾水處理。加入硝酸銀在紫外燈照射下反應(yīng)，用蒸餾水洗后加入硫代硫酸鈉溶液染色，再用蒸餾水洗，用核固紅染液染核，再用酒精和二甲苯處理后封片。用顯微鏡觀察Von Kossa染色組織切片。

Von Kossa染色主要是觀察瓣葉的鈣化情況，該染色方法可以使鈣結(jié)節(jié)呈現(xiàn)可見的黑顏色。從染色結(jié)果看，圖8中沒有看到明顯的黑色鈣化點。從X線分析中看到瓣膜鈣化點僅有一處，主要分布在裙體上。Von Kossa染色結(jié)果與X線結(jié)果一致。

圖8 樣品Von Kossa 染色

1.8 Mo vat染色

將樣品用酒精梯度脫水后，用二甲苯透明處理，再將處理后的樣品用石蠟包埋，用切片機切成4 μm的石蠟帶，最后將樣品進行烤片處理。石蠟切片脫蠟至水，水洗；以1%阿利新藍水溶液染色15 min；用已在60℃預(yù)熱30 min的堿性乙醇分化3～5 s，具體以鏡檢為主；EVG染色30 min，5% FeCl?分化，鏡檢彈力纖維黑色，彈力纖維間隙無色為好；番紅O/酸性品紅染色3～5 min，水稍洗；1%磷鉬酸染1～2 min；直接入1%的冰醋酸分化2～5 min；水稍洗，入天狼猩紅染色2 min，此步不可過長，否則黃色易遮蓋黑色的彈力纖維；以兩缸無水乙醇分化脫水，兩缸二甲苯透明，中性樹膠濕封。用顯微鏡觀察Movat染色組織切片。

用Movat染色法將細胞核和彈力纖維顯黑色，蛋白聚糖顯藍色，膠原纖維網(wǎng)狀纖維顯黃色，心肌平滑肌顯紅色，泡沫細胞顯紫色。豬心包膜主要成分有膠原纖維、彈性纖維，因此在染色中豬心包膜的顏色應(yīng)該是黃色夾雜黑色。圖9中可以看到顯黃色的豬心包膜厚度約為300 μm，其表面都有不同程度的增生物質(zhì)存在。圖9A看到樣品流入端（上側(cè)）表面纖維化，圖9B和圖9C顯示在流出端（下側(cè)）增生組織為棕黃色和藍色相間，說明增生組織主要是膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和蛋白聚糖。據(jù)文獻報道［2］，隨著時間的推移，蛋白多糖被Ⅰ型膠原取代，新生內(nèi)膜組織細胞減少，纖維化程度增加，進而使得瓣葉增厚。

圖9 樣品Movat 染色

1.9 AB-PAS染色

將樣品用酒精梯度脫水后，用二甲苯透明處理，再將處理后的樣品用石蠟包埋，用切片機切成4 μm的石蠟帶，最后將樣品進行烤片處理。將烘烤后的組織切片，用二甲苯脫蠟，脫蠟后的組織切片用梯度酒精和蒸餾水處理。用阿利新藍染色后水洗，高碘酸氧化后用雪夫試劑染色。再用酒精和二甲苯處理后封片。用顯微鏡觀察ABPAS染色組織切片。

以AB-PAS染色法使糖原、中性黏液物質(zhì)呈紅色，酸性黏液物質(zhì)呈藍色，混合性黏液物質(zhì)呈藍紫色或紫藍色，胞核呈藍色。從圖10可以看出，增生組織藍色均勻分布，表明酸性黏多糖的存在。Movat染色結(jié)果與AB-PAS結(jié)果一致，說明增生組織中含有大量酸性黏多糖。

圖10 樣品AB-PAS 染色

1.10 Masson染色

將樣品用酒精梯度脫水后，用二甲苯透明處理，再將處理后的樣品用石蠟包埋，用切片機切成4 μm的石蠟帶，最后將樣品進行烤片處理。將烘烤后的組織切片用二甲苯脫蠟，脫蠟后的組織切片用梯度酒精和蒸餾水處理。用蘇木素染細胞核后，再用麗春紅染色，磷鉬酸處理，苯胺藍染色。用冰醋酸處理后，再用酒精和二甲苯處理后封片。用顯微鏡觀察Masson染色組織切片。

1.11 免疫組化（CD31、CD68和α-SMA）

將樣品用酒精梯度脫水后，用二甲苯透明處理，再將處理后的樣品用石蠟包埋，用切片機切成4 μm的石蠟帶，最后將樣品進行烤片處理。將烘烤后的組織切片用二甲苯脫蠟，脫蠟后的組織切片用梯度酒精和蒸餾水處理。在EDTA（pH8.0）抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，自然冷卻后在脫色搖床上洗滌。在玻片上畫圈，切片加上內(nèi)源性過氧化物酶，在組化圈內(nèi)滴加BSA封閉。加一抗二抗后用DAB顯示，蘇木素復(fù)染細胞核，再用酒精和二甲苯處理后封片。用顯微鏡觀察組織切片。

（1）CD31和CD68染色：CD31與CD68分別是內(nèi)皮細胞和炎性細胞的標(biāo)記物。圖11A和圖11B分別是CD31與CD68標(biāo)記的結(jié)果。從圖11中可以看到樣品在流入端表面存在內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮化主要存在于瓣葉中、下部，自由端幾乎沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞。表明瓣膜中、下端有內(nèi)皮化傾向。瓣膜的內(nèi)皮化可使其表面形成光滑的內(nèi)膜，有助于防止血栓沉積。在流出端和流入端表面局部區(qū)域存在少量炎性細胞，表明血管內(nèi)一直伴有炎癥。

圖11 樣品內(nèi)皮與炎性細胞分析

（2）α-SMA染色：α-SMA是平滑肌細胞的標(biāo)記物，有平滑肌細胞的地方被標(biāo)記成黃色，結(jié)果見圖12A和圖12B。圖中增生組織中含有大量平滑肌細胞，平滑肌細胞零散分布于增生組織內(nèi)，在血管接觸部分平滑肌細胞密度較高。Movat（圖12C）和Masson（圖12D）染色結(jié)果也可以表明平滑肌細胞在增生組織中大量存在。

圖12 α-SMA（A、B）、Movat（C）和Masson（D）染色

2 討論

本研究首次報道了國產(chǎn)自膨脹TAVR瓣膜（Venus A）置入后2年的病理變化。首先從外觀上看瓣膜支架大面積被人體組織覆蓋。在瓣膜流出端，組織覆蓋從瓣膜護耳處往上蔓延，并在瓣葉根部附近覆蓋。在瓣膜流入端，裙體也基本被組織覆蓋。瓣葉上下表面光滑無血栓、無撕裂，瓣葉關(guān)閉功能正常，依舊保持柔軟。從X線與Von Kossa染色分析所知，瓣膜整體基本沒有明顯的鈣化點分布，只有一處分布在裙體上，瓣葉位置沒有發(fā)生鈣化。TAVR術(shù)后2年后，瓣葉和裙體都表現(xiàn)出不同程度的增厚，瓣葉增厚部分在微觀上表現(xiàn)為截面空洞多，纖維結(jié)構(gòu)松散，沒有層次感，裙體增厚幅度要大于瓣葉的增厚幅度。從HE染色圖中可知增生的血管翳厚度可達約300 μm，主要分布在瓣膜流出端，也有少量分布于瓣膜流入端。Movat、AB-PAS染色顯示增生組織中存在蛋白聚糖。用CD31、CD68和α-SMA作為標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)瓣膜瓣葉中下部有內(nèi)皮化傾向，且?guī)в休p微的炎癥。同時增生組織中含有大量平滑肌細胞，而且從免疫組化結(jié)果來看，增生組織中還有大量無法標(biāo)記的成纖維細胞。

目前，關(guān)于經(jīng)皮主動脈瓣膜置入的組織學(xué)分析鮮有報道［2-5］。有研究報道了22例患者瓣膜置入時間從0～2583 d引起瓣葉增厚和瓣膜變性的過程，結(jié)果表明血栓形成、內(nèi)皮增生、纖維化、組織重塑、蛋白酶表達和鈣化等病理變化存在時間依賴性［3］。血栓形成最早發(fā)生于瓣膜置入數(shù)小時內(nèi)，60 d后發(fā)生纖維化，而鈣化多發(fā)生于4年后。與該文獻報道相似，本研究Venus A valve瓣膜TAVR術(shù)后2年后出現(xiàn)內(nèi)皮增生、纖維化導(dǎo)致的瓣葉增厚，但未出現(xiàn)明顯鈣化。根據(jù)既往病理研究報道，經(jīng)皮主動脈瓣膜血栓發(fā)生率為20%～100%，且瓣膜纖維化多與血栓共存，提示瓣膜纖維化可能與血栓相關(guān)。但本病例中未發(fā)現(xiàn)血栓證據(jù)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜覆蓋不完全及少許炎癥，提示可能為纖維化的基礎(chǔ)。

另有研究報道了21例采用Core Valve產(chǎn)品心臟瓣膜置入術(shù)患者從2005至2007年的置入物組織學(xué)分析結(jié)果，組織病理學(xué)檢查表明在瓣膜置入后早期表現(xiàn)為纖維蛋白沉積和炎癥反應(yīng)，隨著時間推移，炎癥反應(yīng)逐漸消退并產(chǎn)生新內(nèi)膜覆蓋［2］。本研究為首個國產(chǎn)瓣膜置入后的組織學(xué)研究，由于病例數(shù)少，很難包括各種臨床場景，具有一定的局限性。但與國外同類產(chǎn)品相比，國產(chǎn)瓣膜置入TAVR術(shù)后2年后的基本組織變化相似。從未來開發(fā)上，針對于早期出現(xiàn)內(nèi)膜過度增生及纖維化這一共性，或許會為仿生化瓣膜的改進提供一個更好的選擇。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突