頂空氣相色譜法測(cè)定乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品中的殘留溶劑

季 璇，戴 青，趙富華，陸連壽，溫 芳，王 雷，韓寧寧，張秀英

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

阿維菌素類藥物是一類應(yīng)用極為廣泛的廣譜高效抗寄生蟲藥，此類藥物能預(yù)防和殺滅家畜動(dòng)物的螨蟲、線蟲等各種寄生蟲。其中阿維菌素B1a和B1b在目前已知的該類藥物中藥效最強(qiáng)，但阿維菌素類藥物具有較大毒性，目前市場(chǎng)上應(yīng)用的都是阿維菌素的衍生物[1-2]。乙酰氨基阿維菌素(圖1)是阿維菌素B1a和B1b的4”位乙?；〈茫瑢俅蟓h(huán)內(nèi)酯類體內(nèi)外殺蟲劑[3-5]。默克公司于1997年開發(fā)出了應(yīng)用于奶牛和肉牛的乙酰氨基阿維菌素，使用時(shí)無(wú)需休藥期，且在牛奶中的殘留量很低，是高效、廣譜和低殘留的新一代獸用驅(qū)蟲藥物，保障了優(yōu)質(zhì)奶源的供應(yīng)，在動(dòng)物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6-8]。

在該藥物制備過程中會(huì)用到多種有機(jī)溶劑，其藥物殘留量會(huì)影響動(dòng)物源性食品安全，在對(duì)照品定值中也必須對(duì)溶劑殘留量明確定量，保證對(duì)照品定值的準(zhǔn)確性[9]。乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品的合成工藝中用了甲醇和丙酮，精制所用的溶劑為乙醇，因此確定甲醇、丙酮和乙醇為殘留溶劑測(cè)定目標(biāo)。但《中國(guó)獸藥典》(2020年版一部)[10]中的殘留溶劑測(cè)定方法僅對(duì)乙醇、乙腈和丙酮進(jìn)行測(cè)定，并未建立本對(duì)照品可能產(chǎn)生的殘留溶劑甲醇的測(cè)定方法，且采用的是直接進(jìn)樣法，而本方法所用的頂空氣相色譜法能夠避免溶液基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，對(duì)殘留溶劑具有富集作用，是一種更高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法[11-13]。截止到目前，國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示持有生產(chǎn)文號(hào)的原料藥生產(chǎn)企業(yè)有7家，注射液生產(chǎn)企業(yè)有67家，在原料藥和注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均需用到乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品，為滿足行業(yè)需求，保障動(dòng)物源性食品安全，對(duì)該對(duì)照品進(jìn)行制備。本文擬建立測(cè)定乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品中3種殘留溶劑的頂空氣相色譜檢測(cè)法，并進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent7890氣相色譜儀(包括7697A型頂空進(jìn)樣器，安捷倫科技公司)；XP105電子天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑 乙醇、甲醇、丙酮對(duì)照品(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Thermo Fisher公司，色譜純)。

1.3 試藥 乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品原料，浙江海正藥業(yè)股份有限公司。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液 取乙醇、甲醇和丙酮對(duì)照品各約2.5、1.5、2.5 g，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，作為甲醇、乙醇和丙酮貯備液。乙醇對(duì)照品溶液：精密量取1 mL乙醇貯備液，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密稱取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；甲醇對(duì)照品溶液：精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密稱取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，精密量取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；丙酮對(duì)照品溶液：精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密稱取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4.2 供試品溶液 取乙酰氨基阿維菌素約0.5 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加DMF 5 mL，搖勻，作為供試品溶液。

1.4.3 空白溶液 取DMF作為空白溶液。

1.4.4 線性與范圍試驗(yàn)溶液 分別精密量取乙醇、甲醇和丙酮對(duì)照品貯備液適量，用DMF稀釋制成濃度分別為974、487、195、98、48、25、11 μg/mL的乙醇對(duì)照品溶液、濃度分別為606、303、121、61、30、15、8 μg/mL的甲醇對(duì)照品溶液和濃度分別為972、486、194、97、49、24、12 μg/mL的丙酮對(duì)照品溶液。

1.4.5 回收率試驗(yàn)溶液 乙醇回收率試驗(yàn)溶液：分別精密量取乙酰氨基阿維菌素9份，每份約0.5 g，3份中分別精密加974 μg/mL的溶液5 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加974 μg/mL的溶液1 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加974 μg/mL的溶液0.2 mL和DMF 4.8 mL作為回收率溶液；甲醇和丙酮回收率試驗(yàn)溶液：分別精密量取乙酰氨基阿維菌素9份，每份約0.5 g，3份中分別精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液5 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液1 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液0.2 mL和DMF 4.8 mL作為回收率溶液。

1.5 色譜條件 色譜柱為Agilent-HP-5毛細(xì)管色譜柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液)；起始溫度50 ℃，保持10 min，再以每分鐘10 ℃的速率升溫至180 ℃，頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min，高純氮?dú)鉃檩d氣，氫火焰離子化檢測(cè)器為檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃。

1.6 靈敏度測(cè)定方法 乙醇：檢測(cè)限溶液：精密量取乙醇對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，定量限溶液：精密量取1 mL乙醇貯備液，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1.2 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；甲醇：檢測(cè)限溶液：見1.4.1項(xiàng)甲醇對(duì)照品溶液配制方法，定量限溶液：精密量取1 mL甲醇貯備液，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；丙酮：檢測(cè)限溶液：精密量取丙酮對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，定量限溶液：精密量取1 mL丙酮貯備液，置250 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，在1.5項(xiàng)的色譜條件下檢測(cè)。

1.7 精密度測(cè)定方法 乙醇溶液：精密量取乙醇貯備液1.9 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；甲醇溶液：精密量取甲醇貯備液1 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；丙酮溶液：精密量取丙酮貯備液2.4 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，分別精密量取以上溶液各5 mL，置20 mL頂空瓶中，重復(fù)測(cè)定6次，在1.5項(xiàng)的色譜條件下檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性 分別精密量取5 mL空白溶液和對(duì)照品溶液于20 mL頂空瓶中進(jìn)行檢測(cè)，乙醇、甲醇和丙酮與DMF的分離度均大于1.5，表明該條件能夠?qū)?種有機(jī)溶劑充分富集，能夠滿足專屬性的要求(圖2)。

圖2 空白溶液(A)、乙醇對(duì)照品溶液(B)、甲醇和丙酮的混合對(duì)照品溶液(C)氣相色譜圖Fig 2 Gas chromatogram of blank solution (A), ethanol reference substance solution (B) and a mixed reference substance solution of methanol and acetone (C)

2.2 檢測(cè)限和定量限 以信噪比為3∶1和10∶1分別作為檢測(cè)限和定量限，測(cè)得乙醇的定量限為11 μg/mL，檢測(cè)限為5 μg/mL，甲醇的定量限為15 μg/mL，檢測(cè)限為4 μg/mL，丙酮的定量限為6 μg/mL，檢測(cè)限為2 μg/mL。

2.3 線性范圍與線性方程 分別精密量取乙醇、甲醇和丙酮的線性與范圍試驗(yàn)溶液5 mL，分別置20 mL頂空瓶中，每份溶液制備2份，頂空進(jìn)樣， 以

濃度和峰面積作線性曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，乙醇在11～974 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=0.34165X-1.5219，r=0.999，甲醇在15～606 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=0.3419X+1.7237，r=0.999，丙酮在12～972 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=1.0804X+4.1559，r=1.000。

2.4 精密度 分別精密量取各精密度試驗(yàn)溶液，置20 mL頂空瓶中，重復(fù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，乙醇峰面積的RSD為10.0%，分別精密量取甲醇和丙酮濃度為15、24 μg/mL的溶液5 mL，重復(fù)測(cè)定6次，甲醇峰面積的RSD為6.6%，丙酮峰面積的RSD為2.5%(表1)。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of Precision test

2.5 準(zhǔn)確度 分別精密量取各濃度回收率試驗(yàn)溶液，置20 mL頂空瓶中，結(jié)果顯示，乙醇的回收率為92.1%～109.9%，甲醇的回收率為94.4%～109.5%,丙酮的回收率為92.5%～102.4%，均在90%～110%范圍內(nèi)(表2)。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of recovery rate test

2.6 耐用性 在方法研究中，對(duì)載氣流速、柱溫、進(jìn)樣口和檢測(cè)溫度進(jìn)行了一定范圍的變動(dòng)，結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性均符合要求，測(cè)定結(jié)果不受影響。

2.7 樣品的測(cè)定 取供試品溶液頂空進(jìn)樣，結(jié)果顯示，供試品甲醇和丙酮的含量均低于定量限，因此可忽略不計(jì)，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中乙醇的含量為0.05%(表3)。

表3 乙酰氨基阿維菌素殘留溶劑測(cè)定結(jié)果Tab 3 Results of residual solvents of eprinomectin

3 討論與結(jié)論

3.1 進(jìn)樣方式選擇 氣相色譜法測(cè)定樣品中的殘留溶劑目前有直接進(jìn)樣和頂空進(jìn)樣兩種方法。美國(guó)藥典采用直接進(jìn)樣法對(duì)乙酰氨基阿維菌素中的殘留溶劑乙腈、甲醇、乙酸異丙酯和庚烷進(jìn)行測(cè)定，廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所等2017年采用直接進(jìn)樣法對(duì)乙酰氨基阿維菌素產(chǎn)品中的乙醇、乙腈和丙酮三種殘留溶劑進(jìn)行測(cè)定[14]，能夠滿足一定的檢驗(yàn)需求，但直接進(jìn)樣法檢測(cè)過程中溶液基質(zhì)會(huì)對(duì)殘留溶劑的測(cè)定有較大的干擾，而本文所用的頂空氣相色譜分析法可以使其氣化后進(jìn)樣，氣化的殘留有機(jī)溶劑的濃度與溶液中相比有很大增加，對(duì)乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品中的殘留溶劑具有良好的富集作用，能夠檢測(cè)出該對(duì)照品中的3種殘留溶劑。另外進(jìn)樣室在較低溫度下操作，可避免藥品組分分解，避免了樣品溶液基質(zhì)的干擾，并可減少樣品本身可能對(duì)色譜系統(tǒng)帶來(lái)的嚴(yán)重污染。

3.2 溶劑選擇 乙酰氨基阿維菌素在水中幾乎不溶，因此本文參照《中國(guó)獸藥典》一部“0861殘留溶劑測(cè)定法”的要求，選用N，N-二甲基甲酰胺作為乙酰氨基阿維菌素的溶劑，該溶劑對(duì)乙醇、甲醇和丙酮均具有良好的溶解性，且色譜圖基線較平直，因此選用N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑。

3.3 色譜條件選擇 由于乙醇、甲醇和丙酮的沸點(diǎn)均低于80 ℃，N，N-二甲基甲酰胺的沸點(diǎn)遠(yuǎn)高于80 ℃，且該溫度下峰面積穩(wěn)定，因此確定頂空瓶的平衡溫度為80 ℃；對(duì)頂空瓶平衡時(shí)間進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示平衡30 min后頂空瓶?jī)?nèi)氣液達(dá)到平衡。

本試驗(yàn)所用乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品的合成工藝中用了甲醇和丙酮，精制所用的溶劑為乙醇，而《中國(guó)獸藥典》(2020年版一部)中該品種的殘留溶劑測(cè)定方法僅對(duì)乙醇、乙腈和丙酮進(jìn)行測(cè)定，并未建立本對(duì)照品可能產(chǎn)生的殘留溶劑甲醇的測(cè)定方法，本試驗(yàn)采用頂空氣相色譜法對(duì)乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品中的3種殘留溶劑乙醇、甲醇和丙酮進(jìn)行了測(cè)定，得出了該對(duì)照品中乙醇?xì)埩羧軇┑暮?，該方法的分離度、重復(fù)性和回收率等指標(biāo)均滿足《中國(guó)獸藥典》中有機(jī)溶劑殘留測(cè)定法的要求，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，回收率高，為獸藥檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供支撐。經(jīng)測(cè)定，對(duì)照品中含有乙醇，限度符合藥典要求，工藝中雖用到了甲醇和丙酮，但在對(duì)照品中未檢出。