一株1型非洲馬瘟疫苗毒種的初步鑒定

王靜文，張 敏，宋亞芬，張 兵，張桂銘，王 磊，苗清新，陳 玲，楊承槐

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

非洲馬瘟是由非洲馬瘟病毒(African Horse Sickness Virus, AHSV)引起的以馬屬動物為主的非接觸性傳染病，以發(fā)熱、皮下水腫及臟器出血為主要特征，臨床上多表現(xiàn)為急性或亞急性，感染馬匹的致死率最高可達95%，被OIE列為必須上報的動物傳染病，同時也是我國一類疫病中唯一的馬屬動物疫病[1]。我國是OIE認(rèn)可的非洲馬瘟無疫國，歷史上從未發(fā)生過非洲馬瘟。2020年3月以來，泰國和馬來西亞相繼暴發(fā)非洲馬瘟疫情，已引起500多匹馬匹死亡，這不僅是時隔60年后亞洲地區(qū)再次發(fā)生非洲馬瘟疫情，也是在非洲大陸外首次出現(xiàn)血清1型AHSV(AHSV-1)的流行[2-3]。隨著國際貿(mào)易的深化和該疫情在東南亞地區(qū)的傳播，非洲馬瘟傳入我國的風(fēng)險亦隨之增大[4]。

為應(yīng)對傳入風(fēng)險，2020年3月28日海關(guān)總署發(fā)布《關(guān)于泰國非洲馬瘟傳入的警示報通報》,4月1日海關(guān)總署聯(lián)合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《關(guān)于防止泰國非洲馬瘟傳入我國的公告》(2020年第48號)[5]，同年9月11日，海關(guān)總署再次聯(lián)合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《關(guān)于防止馬來西亞非洲馬瘟傳入我國的公告》(2020年第105號)[6]。

2020年4月22日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳專門印發(fā)了《關(guān)于做好非洲馬瘟防范工作的通知》(農(nóng)辦牧〔2020〕22號)，要求各單位積極做好相關(guān)技術(shù)儲備。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所負(fù)責(zé)組織開展有關(guān)非洲馬瘟疫苗種毒匹配性分析，并組織具備條件企業(yè)緊急生產(chǎn)、儲備相應(yīng)數(shù)量應(yīng)急用疫苗[7]。由于無特效治療性藥物，疫苗免疫是目前防控非洲馬瘟最有效的方法。常見的商品化AHSV疫苗包括弱毒活疫苗和滅活疫苗。近年來隨著生物技術(shù)的不斷進步，新型疫苗如核酸疫苗、病毒樣顆粒疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗等的研發(fā)也取得了較大進展[8]。

雖然弱毒苗的使用存在著基因重組導(dǎo)致的遺傳變異或是毒力返強的隱患，但相對于滅活苗，弱毒苗仍是目前防控非洲馬瘟的生力軍。且相對于多價苗，單價苗能提供更有效的免疫保護，特別對于單一血清型病毒流行的地區(qū)，單價苗的應(yīng)用更為重要。鑒于此，根據(jù)計劃安排，我們對庫存的一株1型非洲馬瘟病毒疫苗株進行了擴繁和細(xì)胞適應(yīng)性研究，并對其病毒含量、特異性、對小鼠毒力等方面做出初步鑒定。

1 材 料

1.1 毒株 AHSV-1(AV1311株)由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存。

1.2 細(xì)胞 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存并提供。

1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清購自Gibco公司；PBS溶液購自北京中海生物有限公司；RNA提取試劑盒和RT-PCR相關(guān)試劑購自Takara公司；非洲馬瘟1型陽性血清引進自O(shè)IE非洲馬瘟參考實驗室Pirbright研究所。

1.4 實驗動物 昆明小鼠、豚鼠購自北京維通利華有限公司。

2 方 法

2.1 毒種復(fù)壯 取一支AHSV-1(M3代，鼠腦組織毒)用無血清DMEM培養(yǎng)基進行100倍稀釋后，經(jīng)腦內(nèi)接種18～22 g小鼠，0.05 mL/只，共接種18只，設(shè)接種生理鹽水的陰性對照及不接種病毒的空白對照各3只。每日觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。及時解剖死亡小鼠并取其腦組織凍存。試驗結(jié)束后，將所有死亡小鼠的腦組織取出研磨，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞適應(yīng)及傳代 取1支AHSV-1(M3代，鼠腦組織毒)用無血清DMEM培養(yǎng)基進行100倍稀釋，接種75 cm2細(xì)胞瓶的Vero細(xì)胞，每瓶1 mL，37 ℃孵育1 h后，補加含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察，無病變時每120 h進行一次盲傳，至出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時收獲，反復(fù)凍融三次后，再接種Vero細(xì)胞傳代。收獲的病毒液保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 病毒含量測定 用無血清DMEM培養(yǎng)基進行10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7四個稀釋度接種96孔板已長至良好單層的Vero細(xì)胞，每個稀釋度接種5孔，每孔0.1 mL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育120 h。觀察到期后，逐個觀察每孔細(xì)胞病變情況，按照Reed-Muench法進行病毒含量計算。

2.4 小鼠毒力測定 用無血清DMEM培養(yǎng)基進行10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8四個稀釋度腦內(nèi)接種18～22 g小鼠，每個稀釋度接種5只，每只接種0.1 mL。連續(xù)觀察14 d看是否出現(xiàn)死亡或神經(jīng)癥狀等，按照Reed-Muench法計算LD50。

2.5 特異性試驗

2.5.1 PCR法 取F2代的細(xì)胞擴繁毒，按照Takara試劑盒說明書提取病毒RNA并進行反轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)OIE推薦的參考引物，進行PCR擴增。引物序列(表1)和擴增條件如下。

95 ℃ 5 min預(yù)熱后進行如下30個循環(huán)(94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 8 min，4 ℃+∞。在確定分型為AHSV-1型的毒株基礎(chǔ)上，擴增VP7基因PCR條件如下：95 ℃ 5 min預(yù)熱后，進行如下30個循環(huán)(94 ℃ 1 min，53 ℃1 min，72 ℃ 2 min)，72 ℃ 8 min，4 ℃+∞。將條帶正確的PCR產(chǎn)物送中美泰和有限公司進行測序。

2.5.2 血清中和實驗 隨機抽取1支F25代細(xì)胞適應(yīng)毒，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至200 EID50/0.1mL。取1 mL與等體積倍比稀釋的非洲馬瘟1型陽性血清混合，37 ℃作用1 h(期間振搖1次)，接種5孔長成單層的Vero細(xì)胞，每孔0.1 mL，同時設(shè)置病毒對照組和空白對照組。置于37 ℃孵育，觀察記錄120 h內(nèi)出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 毒種復(fù)壯及細(xì)胞擴繁 經(jīng)腦內(nèi)接種AHSV-1(M3代)的昆明小鼠，在接種后72 h開始發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神沉郁，食欲減退，弓背，呼吸微弱且出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)死亡及瀕死小鼠腦組織可見嚴(yán)重出血，96 h后小鼠全部死亡。收集死亡小鼠腦組織，制備一批鼠源基礎(chǔ)種毒，小鼠發(fā)病癥狀和剖檢情況見圖1。

A. 腦內(nèi)出血癥狀；B. 精神沉郁、弓背；C. 強直等神經(jīng)癥狀；D.接種生理鹽水對照A. Intracerebral hemorrhage；B. Depression and hunchbacked；C. Muscle Rigidity；D. Negative Control with saline圖1 腦內(nèi)接種小鼠臨床癥狀Fig 1 Clinical signs in inoculated mice

病毒接種Vero細(xì)胞后盲傳至第5代時，可在接種后144 h出現(xiàn)細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮，開始脫落(圖2)。自第6代開始，孵育120 h后可出現(xiàn)細(xì)胞病變，繼續(xù)傳代至第10代后可穩(wěn)定在48～72 h內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞病變。

A. F3代48 h Vero細(xì)胞病變；B. F10代48 h Vero細(xì)胞病變；C. F15代48 h Vero細(xì)胞病變；D. 正常細(xì)胞對照A. 48 h CPE of F3-passage; B. 48 h CPE of F10-passage;C. 48 h CPE of F15-passage; D. Normal Control圖2 AHSV在Vero細(xì)胞上引起的細(xì)胞病變(1000×)Fig 2 CPE in Vero cell caused by AHSV

3.2 病毒含量測定 采用Vero細(xì)胞測定AHSV-1不同代次毒種的病毒含量，結(jié)果顯示F10、F15、F20代病毒含量分別為106.5、106.5和106.8TCID50/0.1mL，符合《OIE陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》中對非洲馬瘟疫苗病毒含量的要求。

3.3 對小鼠毒力測定結(jié)果 AHSV-1細(xì)胞擴繁毒 F10、F15、F20代對小鼠的半數(shù)致死量分別為106.5、106.8和106.5LD50/0.1mL，鼠源基礎(chǔ)種毒對小鼠的半數(shù)致死量為107.8LD50/0.1mL。

3.4 特異性分析結(jié)果 根據(jù)群特異性引物，可擴增得到約229 bp的AHSV-1型特異性條帶(圖3)，同時以該毒株為模版，擴增VP7基因可得到長度為1179 bp的條帶(圖4)。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該毒株與AHSV 1180株(基因序列號為KP009718)同源性達99.47%，同為血清1型，與2020年泰國暴發(fā)的疫情病原核苷酸同源性可達96.47%。血清學(xué)試驗亦表明，該病毒可被非洲馬瘟1型陽性血清完全中和，特異性良好。

M：Marker; Sample：AV1311-M3/F10/F15/F20; NC：Negative control圖3 分型PCR電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of type-specific gel-based RT-PCR

M：Marker; Sample：AV1311-M3/F10/F15/F20; NC：Negative control圖4 VP7基因擴增PCR電泳圖Fig 4 Electrophoretogram of VP7-gene amplification

4 討 論

2022年3月30日，OIE宣布我國浙江省杭州市桐廬縣為無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)，這對于提升我國在全球動物衛(wèi)生領(lǐng)域的影響力具有重要意義[9]，也對我國防控非洲馬瘟提出了更高要求。因無特效治療性藥物，疫苗免疫成為防控非洲馬瘟最有效的方法[10-11]。

常見AHSV疫苗主要包括弱毒活疫苗和滅活疫苗。20世紀(jì)80年代末，商品化滅活疫苗曾被廣泛用于西班牙、葡萄牙和摩洛哥等地的疫情防控，但因生產(chǎn)成本高、安全風(fēng)險大等原因，目前已停產(chǎn)[12]。AHSV弱毒苗研究始于20世紀(jì)30年代的南非，通過將多株AHSV在小鼠腦內(nèi)進行約100次連續(xù)傳代，成功獲得嗜神經(jīng)性人工致弱毒株，并利用其制備了多價弱毒苗。試驗結(jié)果證明，這種嗜神經(jīng)性毒株制備的弱毒苗可誘導(dǎo)較高滴度的中和抗體[8]。20世紀(jì)60年代之后，利用細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗毒逐漸取代了上述弱毒苗，并在中東及北非等地區(qū)廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)90年代，南非生產(chǎn)的兩種4價弱毒苗 (一種含1、3、4、5型抗原，另一種含2、6、7、8型抗原) 對非洲地區(qū)的非洲馬瘟起到了有效的防控作用。然而，有報道稱5型 AHSV 可對動物產(chǎn)生不良影響甚至導(dǎo)致其死亡，因此基于安全考慮，含5型病毒的弱毒苗于20世紀(jì)90年代初停止使用。南非OBP公司生產(chǎn)的多價疫苗是最為經(jīng)典的非洲馬瘟弱毒苗，多年來在南非等地廣泛使用[13]。該弱毒苗由兩種疫苗構(gòu)成，即疫苗I和疫苗II。疫苗I含1、3、4型抗原；疫苗II含2、6、7、8型抗原，免疫程序為用疫苗I對動物進行首免，3周后用疫苗II對其進行二免。各國通常針對本國疫情流行特點制定相關(guān)單價苗或多價苗的免疫策略，對于單一血清型病毒流行的地區(qū)，單價苗的應(yīng)用更為重要[14]。

AHSV共有9個不同的血清型，之間存在一定的交叉反應(yīng)。為做好緊急防控，此次疫苗種毒擴繁和鑒定工作主要圍繞AHSV-1展開。本試驗所用原始毒株為中監(jiān)所老專家于1960年代從國外引進，年代久遠(yuǎn)，其來源背景和病毒活性等情況不是很清楚，且引進毒均為鼠腦組織毒，不便于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。我們經(jīng)小鼠腦內(nèi)接種復(fù)壯后，證明病毒具有繁殖活性，且選用18～22 g體重區(qū)間的小鼠，潛伏期更短，出現(xiàn)癥狀更快。在細(xì)胞馴化試驗中也采用了鼠源細(xì)胞BHK-21作為對比。雖然病毒在BHK-21細(xì)胞上的增殖速度較Vero細(xì)胞更快，出現(xiàn)病變時間也更早，但考慮到BHK-21細(xì)胞存在致瘤性問題，我們?nèi)赃x擇在Vero細(xì)胞上進行病毒鑒定的后續(xù)研究。不同代次病毒含量測定結(jié)果表明，病毒含量隨著代次增高趨于穩(wěn)步提升，且該Vero細(xì)胞適應(yīng)毒對小鼠也能保有相應(yīng)的毒力。

AHSV屬于呼腸孤病毒科，環(huán)狀病毒屬，其基因組由10個雙鏈RNA片段組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)，其中VP7是形成內(nèi)衣殼的主要蛋白，相對比較保守；VP2蛋白變異性最高，有15個抗原位點，是主要的血清型特異性抗原。RT-PCR檢出率高、特異性強，且快速便捷，是OIE推薦的檢測方法[15-16]。趙文華等基于AHSV L2片段設(shè)計了型特異性引物，可對9個血清型進行分型，基于S7片段設(shè)計了2對引物，可檢測出6種血清型(2、3、4、7、8和9)的AHSV[17]。此外，熒光定量RT-PCR法也逐步建立，如趙文華等根據(jù)VP7蛋白ORF全長建立的“三步法”，可對全部9個血清型擴增[18]；高志強等建立了VP7蛋白和NS2蛋白的雙重Taqman熒光定量法，靈敏度更高，有效降低漏檢率[19]。本實驗中，我們采用的是OIE推薦的通用型引物和自行設(shè)計的型特異性引物，建立了AHSV通用型及分型分子鑒別方法，經(jīng)擴繁的鼠源毒和細(xì)胞毒驗證具有良好的敏感性和特異性，可用于毒種的快速鑒別檢驗。Napawan Bunpapong等使用納米孔測序技術(shù)對8株2020年泰國分離株分析發(fā)現(xiàn)，所有毒株在95V，166S和660I位置都含有獨特的氨基酸，提示傳入泰國的毒株為同一分支[20]。經(jīng)比對VP7基因保守區(qū)域發(fā)現(xiàn)，該毒株與泰國疫情毒株的VP7蛋白只有一個氨基酸的差異，氨基酸同源性達99.7%，可作為一株良好的疫苗毒株候選株。

需要特別說明的是，因AHSV的特殊性，所有試驗均經(jīng)主管部門審批后，嚴(yán)格在ABSL-3實驗室按照生物安全要求操作，嚴(yán)防病毒的泄漏或擴散[21]。非洲馬瘟雖不屬于人獸共患病，但亦有報道顯示一種疫苗毒株可導(dǎo)致人的腦炎和視網(wǎng)膜炎[22]。下一步擬按照《OIE陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》中關(guān)于疫苗毒種的要求，采用蝕斑技術(shù)對該毒種進行克隆純化，并評價其安全性與免疫原性，以進一步完善生產(chǎn)用毒種的鑒定；同時開展RT-PCR和ELISA抗體檢測方法研究，為建立我國高風(fēng)險地區(qū)乃至整個亞太地區(qū)非洲馬瘟快速預(yù)警和監(jiān)測機制提供技術(shù)支撐。