嬰幼兒配方乳粉中OPO的快速檢測

沈祥震，張然，明雙喜，劉偉，高偉偉，楊穎*

山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院（濟(jì)南 250101）

嬰幼兒配方乳粉作為一種比較理想的母乳替代品[1]，能有效地為一些無法正常母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒提供生長發(fā)育所需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)。母乳中含有3.0%～4.5%的脂肪，其中甘油三酯含量占其總脂肪酸含量的98%左右[2]。人體代謝甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸占代謝產(chǎn)物總量的60%～70%[3-4]，1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）作為一種典型的Sn-2棕櫚酸酯，可與膽汁鹽形成乳糜微粒，促進(jìn)脂肪和鈣的吸收，增加骨骼礦物質(zhì)含量和預(yù)防嬰幼兒便秘[5-7]。

近年來，越來越多的國內(nèi)外大型嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)以嬰幼兒配方奶粉中添加OPO為主要賣點(diǎn)進(jìn)行宣傳，雖然食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定OPO在嬰幼兒配方乳粉中的添加量[8]，但國內(nèi)尚未發(fā)布任何關(guān)于OPO的檢測標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的檢測方法主要有薄層色譜分離法[9]、正向液相色譜法[10]、固相萃取分離與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]和氣相色譜法[14-15]。經(jīng)實(shí)際試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述檢測方法在經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性和準(zhǔn)確性等方面不能滿足日常檢驗(yàn)的需求。因此，試驗(yàn)探索一種以酸水解法處理樣品，用乙醚石油醚混合溶液提取嬰幼兒配方乳粉中的OPO，旨在獲得一種準(zhǔn)確度和精密度良好、無需添加內(nèi)標(biāo)、環(huán)境友好、操作簡單、準(zhǔn)確可靠的快速分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀[島津2030型，配有電子捕獲檢測器（FID），日本島津公司]；鹽酸、乙醇、乙醚、石油醚（分析純）；正己烷（色譜純）；氮?dú)猓∟2，純度≥99.9%）；標(biāo)準(zhǔn)品1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（加拿大TRC公司）；試驗(yàn)用超純水（由Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化蒸餾水獲得）。

1.2 色譜條件

毛細(xì)管色譜柱（100%二甲基聚硅氧烷耐高溫色譜柱，柱長15 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.1 μm）；檢測器溫度300 ℃；載氣采用氮?dú)?；恒線速度模式33.1 cm/s；進(jìn)樣口溫度300 ℃。程序升溫：100 ℃，保持3 min，以15 ℃/min的速率升溫至380 ℃，保持10 min。進(jìn)樣方式采用分流進(jìn)樣；分流比20∶1；進(jìn)樣體積1.0 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg 1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量正己烷使之溶解，并于10 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，得到1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液；以標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20和0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

將0.5 g嬰幼兒配方乳粉在5 mL溫水中溶解（液體乳直接稱取5 g樣品），溶解后加入1 mL鹽酸，于65±2 ℃的水浴鍋中水解40 min，水解后冷卻至室溫，加入7 mL乙醇混合均勻，加入20 mL乙醚和石油醚等體積混合溶液，渦旋提取1 min，靜置20 min后離心，取上層有機(jī)相作為提取液，下層水相重復(fù)提取1次，合并有機(jī)相并定容至50 mL，取2 mL提取溶液于40 ℃水浴中氮吹吹干，用正己烷溶解并定容至5 mL，得待測樣品溶液。

1.4.1 水解方式的選擇

取2組乳粉樣品，經(jīng)充分溶解后，分別加入1 mL鹽酸和4 mL氨水進(jìn)行水解，設(shè)置6組平行試驗(yàn)，考察不同水解方法對OPO提取效果的影響。

1.4.2 乙醇加入量對OPO提取效果的影響

取不同試驗(yàn)組，分別加入0，2，5，10和15 mL無水乙醇，考察不同乙醇加入量對OPO提取效果的影響。

1.4.3 不同提取溶劑對OPO提取效果的影響

結(jié)合GB 5413.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》中脂肪的提取方法以及1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯易溶于烷烴類溶劑的特性，選取乙醚石油醚等體積混合溶液、正己烷和正庚烷3種提取溶劑進(jìn)行比較分析。

1.4.4 溶劑使用量及提取次數(shù)對OPO提取效果的影響

將待測樣品分為4組，分別為①②③④，每組樣品3個(gè)平行，組①中待測樣品經(jīng)水解并加入乙醇后，加入10 mL乙醚渦旋提取2 min，加入10 mL石油醚渦旋提取2 min，靜置分層后將有機(jī)層取出至100 mL容量瓶中，水相重復(fù)上述提取步驟進(jìn)行第2和第3次提取，合并有機(jī)相至100 mL容量瓶中，并用乙醚石油醚等體積混合溶液定容至刻度，準(zhǔn)確移取5 mL有機(jī)相提取液，氮吹至干后以5 mL正己烷復(fù)溶，待上機(jī)。組②以體積比1∶1的乙醚+石油醚混合溶液作為提取溶劑，待測樣品經(jīng)水解并加入乙醇后，加入20 mL體積比1∶1的乙醚+石油醚混合溶液，渦旋提取2 min，靜置分層后將有機(jī)層取出至100 mL容量瓶中，水相重復(fù)上述提取步驟進(jìn)行第2和第3次提取，合并有機(jī)相至100 mL容量瓶中并用乙醚石油醚等體積混合溶液定容至刻度，準(zhǔn)確移取5 mL有機(jī)相提取液，氮吹至干后以5 mL正己烷復(fù)溶，待上機(jī)。組③同組②，只不過不再進(jìn)行第3次提取。組④也同組②，但只進(jìn)行第1次提取。對溶劑使用量及提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 水解方式的選擇

取2組乳粉樣品，經(jīng)充分溶解后，分別加入1 mL鹽酸和4 mL氨水進(jìn)行水解，考察不同水解方法對OPO提取效果的影響，設(shè)置6組平行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 不同水解方法對OPO提取效果的影響

由表1可以看出，酸水解法的提取效率和精密度均優(yōu)于堿水解法。由于乳制品中的脂類多以結(jié)合態(tài)脂肪球形式存在，而脂肪球的周圍有一層膜以使脂肪球在乳中保持穩(wěn)定，采用一定濃度的酸或氨水使非脂成分溶解，乳中酪蛋白鈣鹽轉(zhuǎn)變成可溶性蛋白或蛋白銨鹽，脂肪球膜被軟化破壞，從而使結(jié)合態(tài)的脂類得以游離出來。

使用鹽酸水解法水解更徹底，加入有機(jī)試劑提取時(shí)在有機(jī)相與水相分層的界面處會形成一個(gè)蛋白質(zhì)水解物的白色薄膜，使分層更為明顯（圖1b）；而堿水解法由于水解不夠充分，加入有機(jī)試劑提取時(shí)在有機(jī)相與水相分層的界面處會形成一定厚度的乳化層（圖1a），不利于試驗(yàn)的進(jìn)行。

圖1 不同水解方式對OPO提取效果的影響

2.1.2 乙醇加入量對OPO提取效果的影響

樣品經(jīng)水解后加入不同量的乙醇溶液，考察不同乙醇加入量對OPO提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，乙醇加入量5～10 mL能達(dá)到較為理想的提取效果。待測樣品經(jīng)酸水解后加入一定量的乙醇溶液，一方面使能溶于乙醇的物質(zhì)進(jìn)入水相，減少一些非脂成分進(jìn)入有機(jī)層；另一方面能促使樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，不易產(chǎn)生乳化。綜合考慮試驗(yàn)成本及提取效果，試驗(yàn)采用7 mL乙醇進(jìn)行提取。

2.1.3 提取溶劑的選擇

由圖3可以看出，在選取乙醚石油醚等體積混合溶液作為提取溶劑時(shí)，對樣品中OPO的提取效率明顯優(yōu)于正己烷和正庚烷組。乙醚具有較強(qiáng)的溶解脂類物質(zhì)的能力，除此之外還能溶解游離脂肪酸、醇、磷脂及色素等脂溶性物質(zhì)。石油醚不溶于水，能溶解脂肪、游離脂肪酸，不易溶解醇、磷脂和色素。使用乙醚石油醚等體積混合溶液作提取溶劑時(shí)，石油醚的加入能有效降低乙醚的極性，促進(jìn)乙醇進(jìn)入水層，使溶于水相的部分乙醚被競爭出來，從而使有機(jī)相與水相更好分層。

圖3 提取溶劑對OPO提取效果的影響

2.1.4 溶劑使用量及提取次數(shù)對OPO提取效果的影響

由圖4可以看出，對比組①和組②可以看出，乙醚和石油醚分步提取與乙醚石油醚等體積混合溶液提取2種提取方式對樣品中OPO提取效率的影響無顯著性差異。對比組②，組③和組④可以看出，使用乙醚石油醚等體積混合溶液提取2次即能達(dá)到較為理想的提取率。故試驗(yàn)選用乙醚石油醚等體積混合溶液作為提取溶劑，提取次數(shù)為2次。

圖4 提取體積及提取次數(shù)對樣品中OPO提取效果的影響

2.2 方法的考察

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限

試驗(yàn)以不添加OPO的乳粉樣品為基質(zhì)，按1.3的方法進(jìn)行處理得到質(zhì)量濃度0.01，0.02，0.05，0.1，0.20和0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2的分析方法測定，采用外標(biāo)法定量。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL）繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果表明，OPO在0.01～0.5 mg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程為Y=553 441X-1 264.9，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，試驗(yàn)中以所得到的3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限，以所得到的10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限，方法的檢出限和定量限分別為0.06 g/100 g和0.2 g/100 g。該方法可滿足乳制品中OPO含量分析的要求。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品工作液及樣品提取液色譜圖

2.2.2 精密度試驗(yàn)

通過上述方法對同一添加OPO的嬰幼兒乳粉樣品進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算出OPO的含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD=0.704%，表明其精密度良好。

表2 同一嬰幼兒乳粉中OPO含量的測定

2.2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在0.2，2.0和10.0 g/100 g這3個(gè)添加水平下，樣品的回收率分別為98.6%，96.4%和101.5%，表明測定結(jié)果均具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

以酸水解法對樣品溶液進(jìn)行水解后，用乙醚、石油醚等體積混合溶劑提取脂肪，可將嬰幼兒配方乳粉中的脂肪酸充分提取，利用毛細(xì)管色譜柱以程序升溫的方式對目標(biāo)化合物進(jìn)行分離，氫火焰離子化檢測器（FID）檢測，實(shí)現(xiàn)1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯同分異構(gòu)體的分離。該方法方便、快捷，定性準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，可用于嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的實(shí)驗(yàn)室快速批量檢測。