LncRNA-NEAT1在子宮內(nèi)膜癌中的臨床病理意義及其在預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

羅艷露,范江濤,楊家湟

核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是LncRNA的一種，在病毒感染及腫瘤等疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[1]。目前已有研究報(bào)道了NEAT1在多種實(shí)體瘤中表達(dá)異常，例如肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌等，其高水平表達(dá)與腫瘤的不良結(jié)局相關(guān)[2]。表明了NEAT1具有致癌特征，此外，NEAT1可用作癌癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，在作為治療腫瘤的新靶點(diǎn)上蘊(yùn)含巨大的潛力。

近年來(lái)關(guān)于NEAT1在子宮內(nèi)膜癌(endometnal cancer,EC)的基因分析研究表明，在EC組織及細(xì)胞系中NEAT1的表達(dá)顯著上調(diào)，抑制NEAT1的表達(dá)可以減少侵襲性EC細(xì)胞的增殖、侵襲，提示了NEAT1可以促進(jìn)EC的發(fā)生發(fā)展[3-7]。但關(guān)于NEAT1與EC臨床病理參數(shù)的關(guān)系尚不清楚，及其對(duì)EC生存預(yù)后的影響研究較少。為進(jìn)一步探索NEAT1對(duì)EC的臨床病理意義及生存價(jià)值，本研究檢測(cè)了EC患者的EC灶組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常內(nèi)膜組織中NEAT1的表達(dá)情況，探索NEAT1表達(dá)水平與EC不同臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及其生存預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的收集

本研究選取了36例EC患者在手術(shù)中切除的癌灶組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常內(nèi)膜組織。癌旁組織為離癌灶組織≥2 cm的正常內(nèi)膜組織。離體組織放入液氮或-80℃冰箱保存。樣本來(lái)自2016年7月至2017年2月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的符合條件的EC患者。所有病歷均由病理科確診為EC。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診原發(fā)EC，初始治療為接受子宮及雙附件切除+盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)±腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)切除術(shù)的患者(當(dāng)術(shù)中探查發(fā)現(xiàn)可疑腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者具有高危因素者行腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)切除術(shù)或者活檢術(shù))。排除標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)前接受過(guò)激素治療、化療或者放療的患者，合并其它惡性腫瘤。本研究提前獲得了患者及家屬的同意并簽署相關(guān)知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有樣本均具備完整的臨床病理資料。

1.2 通過(guò)RT-qPCR計(jì)算NEAT1的相對(duì)表達(dá)量

EC組織和癌旁正常組織樣本的總RNA提取是利用經(jīng)典的Trizol試劑法，提取到的總RNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量，濃度范圍為：425～4 110 ng/uL，純度(A260/A280)為1.85～2.05。

按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，取1μg總RNA放入反應(yīng)體系中，在PCR儀(Gene Amp)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，5 s。

本次RT-qPCR選用GAPDH作為內(nèi)參基因，它的上游引物為：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物為：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。目的基因NEAT1的上游引物：TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG。下游引物為：TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC，RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中cDNA 2 μL。反應(yīng)儀器：7500熒光定量PCR儀。反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃,5 s；60℃ 34 s；95℃ 15 s； 60℃，1 min，95℃，15 s。共40個(gè)循環(huán)。在本次實(shí)驗(yàn)中計(jì)算NEAT1的基因表達(dá)量的公式為2-△CT，△CT=CT癌灶/正常-CTGAPDH。

1.3 臨床病理病歷收集

通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病歷記錄獲得，收集包括年齡、臨床-病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管侵犯、腹水檢測(cè)、深肌層侵犯、腫瘤大小、組織分化、分子分型等相關(guān)資料。通過(guò)電話隨訪及就診追蹤，獲得36例患者截至2020年11月的生存預(yù)后情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NEAT1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況

通過(guò)公式2-△CT計(jì)算每個(gè)樣本表達(dá)量，得到了36例患者的EC灶組織NEAT1的表達(dá)量均高于其相對(duì)應(yīng)的癌旁正常內(nèi)膜組織，癌灶組NEAT1表達(dá)量：1.431±0.724，正常組為：0.274±0.071。NEAT1在EC組織中的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜組織(t=9.538,P<0.001)。

2.2 NEAT1在子宮內(nèi)膜癌中的臨床病理意義

根據(jù)臨床、病理病歷的記錄，將36例患者以年齡、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、深肌層浸潤(rùn)、腹水癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果、腫瘤組織分化、腫瘤大小、分子分型等常見的臨床病理因素作為依據(jù)進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，NEAT1的表達(dá)在分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深肌層浸潤(rùn)、腹水癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果、腫瘤組織分化、腫瘤大小、分子分型之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在年齡、脈管侵犯之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見下頁(yè)表1。

表1 NEAT1在各個(gè)臨床病理因素中表達(dá)情況的比較

2.3 NEAT1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌各臨床病理因素及生存預(yù)后的關(guān)系

以36例患者癌灶組織NEAT1表達(dá)量的中位數(shù)水平為閾值，將36例患者分為高、低表達(dá)兩組，每組各18例。四格表χ2檢驗(yàn)比較兩組患者年齡、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、深肌層浸潤(rùn)、腹水癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果、腫瘤組織分化、腫瘤大小、分子分型等一般資料比較，結(jié)果顯示差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁(yè)表2。

表2 NEAT1高、低表達(dá)兩組臨床病理因素比較 [例(%)]

2.3.1 NEAT1高、低表達(dá)兩組生存預(yù)后情況的比較 Kaplan-Meier法計(jì)算高表達(dá)組3年的中位生存時(shí)間為(36.289±4.356)月,3年生存率為53%，而低表達(dá)組的3年的中位生存時(shí)間為(48.144±2.478)月,3年生存率為77%，Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=4.809,P=0.028)，詳見下頁(yè)圖1(A)。表明了NEAT1的高表達(dá)降低了患者的生存率。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組3年無(wú)瘤生存率為42%，中位無(wú)瘤生存時(shí)間為(36.196±4.264)月，而低表達(dá)組3年無(wú)瘤生存率為72%，中位無(wú)瘤生存時(shí)間為(50.078±2.092)月，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=7.848,P=0.005)，詳見下頁(yè)圖1(B)，表明NEAT1可以影響EC患者的復(fù)發(fā)。

圖1 (A)高低表達(dá)兩組總生存曲線比較

圖1(B) 高低表達(dá)兩組無(wú)瘤生存曲線比較

2.3.2 影響患者總生存和無(wú)瘤生存的單因素及多因素Cox回歸分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，NEAT1表達(dá)高低、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和組織分化高低程度與患者的總生存期有關(guān)(P<0.05)；NEAT1表達(dá)高低、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的無(wú)瘤生存率有關(guān)(P<0.05)。多因素Cox回歸分析，NEAT1高表達(dá)(HR=0.101，95%CI:0.01-0.981，P=0.048)是影響總生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是影響患者無(wú)瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=0.081， 95%CI:0.01-0.66，P=0.019)，詳見表3。

表3 影響患者總生存及無(wú)瘤生存的單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

越來(lái)越多的研究證明，LncRNA是癌癥潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，它們與許多基因相互作用，而這些基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞表型與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，包括細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡對(duì)抗。NEAT1作為最常見的LncRNA之一，在各種實(shí)體癌癥中表達(dá)上調(diào)，癌癥組織樣本中NEAT1的表達(dá)水平與癌癥進(jìn)展、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床結(jié)局有關(guān)[8]。Zhang M等[9]證實(shí)了NEAT1在直腸癌患者的癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，改變直腸癌細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)可以導(dǎo)致體內(nèi)及體外癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的顯著改變，此外，他們還探索了NEAT1的表達(dá)在直腸癌中的臨床病理意義，提出了NEAT1與直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)。Wen S等[10]發(fā)現(xiàn)了NEAT1-1 m6A能夠促進(jìn)有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌PDXs中新復(fù)合物CYCL INL1/CDK19的致癌功能，表明了NEAT1-1m6A在調(diào)節(jié)前列腺癌進(jìn)展中具有重要作用，可能是癌癥治療和診斷的新靶點(diǎn)。Ma F等[11]研究表明NEAT1通過(guò)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)提高肺癌細(xì)胞的生存能力和遷移能力，另一方面，他們還發(fā)現(xiàn)NEAT1在肺癌組織及肺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，這種異常表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為肺癌的發(fā)病機(jī)制提供新思路。Ding N等[12]發(fā)現(xiàn)NEAT1在卵巢癌細(xì)胞株中顯著上調(diào)，并能通過(guò)miR-34a-5p/BCL2調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡，提示NEAT1可以調(diào)控卵巢癌的進(jìn)展，為卵巢癌患者提供一種潛在的治療途徑。關(guān)于NEAT1與EC，目前學(xué)者們一致認(rèn)為NEAT1在EC組織或細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且NEAT1可以促進(jìn)EC的進(jìn)展。本研究在相關(guān)研究的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探索NEAT1在EC中的臨床病理意義，評(píng)估其作為EC患者生存預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物的潛力，旨在為EC臨床診治提供新策略。

NEAT1的差異性表達(dá)在EC的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色。Dong P等[13]發(fā)現(xiàn)NEAT1在EC細(xì)胞系中呈高表達(dá)，在體內(nèi)和體外的研究中利用ShRNA抑制NEAT1的表達(dá)可以減少侵襲性EC細(xì)胞的增殖、侵襲及異種移植腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步探索其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)NEAT1是作為腫瘤抑制因子miR-361致癌體，直接靶向癌基因STAT3來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞表型，指出NEAT1是積極推動(dòng)EC進(jìn)程的重要因子。另外，關(guān)于NEAT1在人體EC組織及正常內(nèi)膜組織中的差異性表達(dá)曾被報(bào)道過(guò)4次，這些研究均證實(shí)了EC組織中的NEAT1的表達(dá)高于正常內(nèi)膜組織，還在細(xì)胞水平上證實(shí)了NEAT1通過(guò)靶向包括miR-144-3p、miR-146b-5p、miR-202-3p等小核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)EC細(xì)胞侵襲、生長(zhǎng)等細(xì)胞行為的調(diào)控[14]。與這些研究一致，我們的研究結(jié)果表明NEAT1表達(dá)水平與EC進(jìn)展之間存在正相關(guān)，EC組織中NEAT1表達(dá)可能是EC的診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物。下一步計(jì)劃進(jìn)行體外和體內(nèi)研究，以鑒定NEAT1在EC細(xì)胞惡性表型中的作用和機(jī)制。

關(guān)于NEAT1在EC中的臨床病理意義，Li Z等[4]研究表明NEAT1的表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，而與患者年齡、深肌層侵犯、組織分級(jí)及更年期狀態(tài)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。本研究在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行更進(jìn)一步、更全面的探索，結(jié)果揭示了NEAT1與EC患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深肌層浸潤(rùn)、腹水癌細(xì)胞陽(yáng)性、組織分化及腫瘤大小之間明顯相關(guān)。因此，我們認(rèn)為在臨床檢測(cè)NEAT1的表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)EC轉(zhuǎn)移和惡化可能是有價(jià)值的，當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，本研究探索NEAT1對(duì)EC生存預(yù)后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEAT1高表達(dá)會(huì)縮短EC患者的生存時(shí)間及增加患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)此，我們可以大膽提出NEAT1作為EC新的潛在診斷和治療靶點(diǎn)的假設(shè)。盡管樣本數(shù)量很少，但由于采用了嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格選擇匹配的臨床病理因素以降低有爭(zhēng)議結(jié)果的可能性，因此我們認(rèn)為樣本是具有合理性和代表性的。

綜上所述，我們認(rèn)為NEAT1可能促進(jìn)EC進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，影響EC的生存預(yù)后，可以作為監(jiān)測(cè)EC進(jìn)展及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，具備作為治療EC新靶點(diǎn)的潛力。然而，未來(lái)仍需要更多、更深入的研究來(lái)證實(shí)NEAT1的臨床應(yīng)用價(jià)值。