屏風(fēng)四妙湯治療復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病小鼠模型療效及機制研究*

宋桂紅，邢冬杰，劉陶然

山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，山東 煙臺 264199

外陰陰道白色念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是常見的婦科疾病，雖然該病病原體明確，治療效果明顯[1-2］，但仍有5%的復(fù)發(fā)率[3-5］。由于外陰瘙癢嚴重影響了RVVC 患者的工作、生活質(zhì)量及身心健康[6］，如何提高RVVC 治愈率、減少復(fù)發(fā)率是目前RVVC 的研究重點。中醫(yī)認為RVVC 病機為濕熱內(nèi)蘊、下注陰中，正氣不足，濕性黏滯、熱與濕合、膠著難除是RVVC 病情纏綿難愈的重要原因[7］。玉屏風(fēng)散與四妙丸均為中醫(yī)傳統(tǒng)名方。玉屏風(fēng)散補氣固表，具有調(diào)節(jié)人體免疫力的功效[8］；四妙丸具有補腎健脾，清熱除濕的作用[9］。二方相合組成的屏風(fēng)四妙湯，具有扶正祛邪、標本兼治的功用，對RVVC 的復(fù)發(fā)有著良好的預(yù)防與治療作用。本研究將屏風(fēng)四妙湯用于不同免疫狀態(tài)小鼠，以探究其對RVVC的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇ICR雌性小鼠120只，8～10周齡，體質(zhì)量23～27 g，購自武漢華聯(lián)科有限公司，實驗動物許可證號：SYXK（鄂）2018-0104，動物實驗遵循3-R 原則。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)房溫度控制在25℃，空氣濕度維持在40%～60%，采取人工光照，晝夜各12 h。

1.2 藥物及試劑ATCC10231白色念珠菌標準株（上海復(fù)祥生物科技有限公司，批號：201903041）；防風(fēng)、黃芪、白術(shù)、黃柏、蒼術(shù)、牛膝和薏苡仁等中藥均由山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院中藥房提供；辣根過氧化酶標記抗體（上海迪申生物技術(shù)有限公司，批號：191013）；沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（上海麗臣生物科技有限公司，批號：1086835）；CD11c+抗體（艾博抗有限公司，貨號：EP1347Y；批號：ab52632）；EliVision plus 試劑盒（中國福州邁新生物科技有限公司，貨號：kit-9902，批號：191124）；DAB Kit（中國福州邁新生物科技有限公司，貨號：DAB-1031，批號：191014）；蘇木素染色液（中國南京建成公司，批號：200526）；檸檬酸鈉緩沖液（中國福州邁新生物科技有限公司，批號：190811）；蘇木素-伊紅染液試劑盒（中國福州邁新生物科技有限公司，批號：190919）。

1.3 實驗儀器101AS-3型干燥箱（日本Olympus公司），BCD-258A/C 型冰箱（盛世元和公司）；BX41型生物倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；E200 型天平（德國賽多利斯）；耐高溫塑料染色架（中國福州邁新，貨號：RAK-2001）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將120只ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采用隨機數(shù)字表法分為A、B、C 組，每組16只；D、E、F組，對照組，每組18只。

1.4.2 模型制備 白色念珠菌采用陰道內(nèi)接種：接種時取20 μL 真菌懸液（即白色念珠菌孢子接種量為5×104），在接種日注入所有小鼠陰道內(nèi)，接種后倒置5 min 防止菌液溢出。1）A、B 組于接種白色念珠菌前10 天開始每只小鼠隔日皮下注射1 mg/mL苯甲酸雌二醇油劑0.1 mL，構(gòu)建為雌激素化接種白色念珠菌組。2）C、D 組均于接種白色念珠菌前1 天、接種日、接種后1 天給予地塞米松（成都天臺山制藥有限公司，批號：20191014，規(guī)格：0.5 mL/支）腹腔注射0.15 mL，構(gòu)建免疫抑制接種白色念珠菌組。3）E、F 組隔日皮下注射植物油0.1 mL，構(gòu)建為正常免疫組。4）A、C、E各組小鼠接種白色念珠菌前10 天開始灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑（10 g生藥/kg體質(zhì)量），為中藥干預(yù)組。5）B、D、F各組小鼠灌服等體積生理鹽水。

1.4.3 試藥制備 將防風(fēng)、黃芪、白術(shù)各30 g，黃柏10 g，蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁各15 g 放入不銹鋼鍋中，加純凈自來水700 mL，浸泡30 min，煎取藥液300 mL；二煎加開水400 mL，煎取藥液200 mL。合并藥液，濃縮為150 mL、過濾，濾液加蒸餾水調(diào)制藥物濃度0.125 mg/mL，4～8℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 藥物干預(yù) 除對照組外各組小鼠陰道接種白色念珠菌。接種菌量5×104；A 組雌激素+中藥處理10 天；B 組雌激素處理10 天；C 組地塞米松3 次+中藥處理10 天；D 組地塞米松處理3 次；E 組植物油+中藥處理10 天；F 組植物油處理10 天；其中A、C、E各組小鼠接種白色念珠菌前10天開始灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑（10 g 生藥/kg 體質(zhì)量）；B、D、F各組小鼠灌服等體積生理鹽水。

1.5 觀察指標

1.5.1 IHC法檢測小鼠陰道內(nèi)CD11C+水平[10］治療結(jié)束后，以斷頸法處死小鼠，摘取其陰道組織，用剪刀剪碎后，經(jīng)過石蠟切片、抗原修復(fù)、滅活酶、封閉、加入抗體CD11C+抗體稀釋倍數(shù)（1∶500），加入增強劑，使用二氨基聯(lián)苯胺（diamino benzidine，DAB）溶液顯色、蘇木素染液復(fù)染、脫水封片在400 倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，取3個表達區(qū)域拍照保存。

1.5.2 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察小鼠病理情況[11］摘取小鼠陰道組織，置于4%多聚甲醛固定，然后常規(guī)石蠟包埋，HE 染色，根據(jù)陰道黏膜組織炎性浸潤、充血、水腫情況進行評分，每種病理損傷以0～4 分評估，得分越高表示組織病理損傷越嚴重。

1.5.3 碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS）觀察小鼠病理情況[12］摘取小鼠陰道組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水，蒸餾水清洗10 min，Schiff 氏液染色10 min，流水沖洗5 min，蘇木素染色3 min，再次脫水、透明，封片在400 倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，取3個表達區(qū)域拍照保存。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD11c+免疫組化圖由免疫組化圖片可以看出，對照組大面積被染成棕黃色，陽性細胞較多；C組陽性細胞數(shù)量最少，其次為A、B、D、F、E組。見圖1。

2.2 CD11c+值檢測各組CD11c+表達可以發(fā)現(xiàn)，與對照組光密度值比較，A、B、D、C、F、E 組光密度值下降（P＜0.05），其中C組最顯著。見圖2。

2.3 病理損傷評分與對照相比，A、B、C、D、E、F組小鼠病理評分總分顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠病理損傷評分比較（±s） 分

表1 各組小鼠病理損傷評分比較（±s） 分

注：*表示與對照組比較，P＜0.05

組別對照組A組B組C組D組E組F組黏膜上皮細胞鼠數(shù)18 16 16 16 18 18 18糜爛0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00潰瘍0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00炎性浸潤0.00±0.00 0.64±0.48 0.83±0.95 0.38±0.48 1.00±1.73 1.67±1.53 1.00±1.00黏膜下組織充血0.20±0.15 0.30±0.00 0.37±0.25 0.63±0.25 0.50±0.50 0.67±0.57 0.67±0.58炎性浸潤0.15±0.18 0.25±0.00 0.38±0.25 0.38±0.48 0.50±0.50 0.50±0.50 0.67±0.58水腫0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00總分0.38±0.16 1.10±0.26*1.75±0.96*1.38±0.63*2.00±2.65*2.00±2.65*2.33±2.08*

2.4 小鼠HE 染色和PAS 染色圖經(jīng)HE 染色和PAS 染色圖顯示，對照組小鼠陰道黏膜被覆扁平上皮、表面無明顯角化、無潰瘍、無糜爛，黏膜下組織無明顯充血、炎性浸潤和水腫情況。A 組陰道黏膜上皮角化程度、炎細胞浸潤程度減輕；B 組陰道黏膜上皮角化、無潰瘍糜爛、輕微炎細胞浸潤；C組陰道黏膜上皮部分有不均勻皮角化、無糜爛潰瘍、輕度炎細胞浸潤，黏膜下組織輕度充血、炎細胞浸潤；D 組陰道黏膜上皮角化厚薄不一、大量炎性細胞浸潤、局部糜爛壞死，黏膜下組織輕度充血、炎性細胞浸潤；E 組陰道黏膜被覆復(fù)層扁平上皮、部分角質(zhì)化、炎細胞浸潤得到改善，黏膜下組織輕度充血、炎細胞浸潤；F 組陰道黏膜被覆復(fù)層扁平上皮、角質(zhì)化、中度炎細胞浸潤、局壞死，黏膜下組織輕度充血、炎細胞浸潤。見圖3。

3 討論

念珠菌性陰道炎是婦科常見病，雖然抗真菌藥物可以有效緩解陰道炎癥，但隨著使用藥物的增加，病菌的耐藥性也會變強[13-14］。因此本研究尋求中藥治療念珠菌性陰道炎以降低真菌的耐藥性。

CD11c 屬于細胞表明的跨膜蛋白，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細胞增殖、分化生理過程，CD11c+細胞可以通過影響T 淋巴細胞的分化程度影響機體組織免疫反應(yīng)。本研究檢測了CD11c+水平，與對照組比較，A 組小鼠CD11c+含量水平顯著降低，黏膜上皮細胞炎性浸潤顯著增強，黏膜下組織炎性浸潤得到了顯著的改善，這是由于A 組灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑，所以可以認為灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑可以降低黏膜下組織炎性浸潤，但對黏膜上皮細胞無明顯改善。與B 組相比，A 組CD11c+顯著升高且黏膜上皮細胞和黏膜下組織炎性浸潤均顯著改善，這是由于服用屏風(fēng)四妙湯煎劑增強了CD11c+的表達。所有組別中，C 組的CD11c+表達最低，這是由于因為接種了免疫抑制白色念珠菌，使得小鼠陰道中的白色念珠菌減少，同時抑制了陰道內(nèi)的免疫細胞功能。D組CD11c+水平顯著升高，這是由于D 組沒有接種免疫抑制白色念珠菌，使得小鼠陰道內(nèi)的細胞免疫未受到抑制，因此使得CD11c+的表達升高。相比D 組，E 組小鼠CD11c+顯著升高，且黏膜上皮細胞中的炎性浸潤顯著升高，說明灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑可以增強小鼠細胞內(nèi)的免疫，同時CD11c+DC 數(shù)目增多且DC 主要分布在上皮細胞。E組小鼠病理評分與D組無顯著差異，但CD11c+水平顯著高于D組，這是由于灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑后，小鼠的細胞免疫受到促進，使得其CD11c+水平升高。相比E 組，F(xiàn) 組小鼠病理學(xué)評分顯著升高，但CD11c+水平降低，這是由于E 組和F組均為正常免疫，但E 組小鼠病理損傷較低，這是由于灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑可以有效緩解小鼠病變程度。汪平等[15］研究表明：四妙湯可以有效緩解小鼠病變程度，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，小鼠陰道接種白色念珠菌主要病變?yōu)殛幍鲤つは鲁溲脱准毎?，以嗜酸性粒細胞為主，灌服屏風(fēng)四妙湯煎劑可以有效緩解白色念珠菌感染小鼠陰道內(nèi)黏膜充血和炎癥細胞浸潤。