視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中miR-142的表達(dá)及對細(xì)胞增殖和侵襲力的影響

羅 鋼，蔡麗英，咼 明（.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北黃石 435000；.荊州市中心醫(yī)院，湖北荊州 434000）

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）作為兒童期常見的眼部惡性腫瘤，起源于胚胎型光感受器前體細(xì)胞，超過60%的患兒發(fā)病年齡在3歲以內(nèi)[1]，該腫瘤惡性程度高，致殘、致盲率高，易發(fā)生顱內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]，對患兒生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前，對該病的治療主要是手術(shù)摘除、放化療、冷凍、光凝等，但這些治療方法副作用大，對患兒身體傷害大，總體預(yù)后不佳[3]，因此，積極尋找有效的治療方案以保留患兒眼球和視力、提高患兒生存率已成為臨床研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著分子靶向治療技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為RB診療提供了新的前景[4]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類長度在19～22個核苷酸的高度保守的內(nèi)源性RNA，在機(jī)體組織、器官中廣泛存在，在多項(xiàng)生理病理過程中發(fā)揮重要作用[5]，近年來研究發(fā)現(xiàn)[6]，其可通過調(diào)控靶基因表達(dá)而參與了多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程。miR-142作為一種miRNA，在腫瘤組織中出現(xiàn)異常表達(dá)[7]，參與了腫瘤細(xì)胞異常增殖，且可加速細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[8]。本研究檢測了RB組織中miR-142表達(dá)，比較了不同臨床指標(biāo)間差異性，并通過對人RB細(xì)胞株Y79轉(zhuǎn)染miR-142模擬物，觀察其對細(xì)胞增殖和侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2013年6月～2019年6月在黃石市中心醫(yī)院接受眼球摘除手術(shù)治療的RB患兒，納入標(biāo)準(zhǔn)：①單側(cè)眼；②術(shù)前未行放化療；③術(shù)后病理確診。排除心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者、急慢性感染者，以及神經(jīng)系統(tǒng)疾患者。共入選患兒79例（79眼），其中，男性48例，女性31例，年齡4個月～10（3.86±0.92）歲，眼側(cè)：左側(cè)42例，右側(cè)37例；分化程度：未分化型36例，分化型43例；出現(xiàn)神經(jīng)浸潤41例。收集RB組織和癌旁正常組織（距離癌組織邊緣1～2cm范圍內(nèi)），-80℃液氮保存。本研究由醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及總RNA提取液（美國Invitrogen公司），人RB細(xì)胞株Y79（上海通蔚生物），RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶和青-鏈霉素雙抗（美國Gibo公司），逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增試劑（大連寶生物），miR-142和U6（上海生工生物），miR-142模擬物和陰性對照序列（上海吉熒生物），噻唑藍(lán)（MTT）液（南京信帆生物），二甲基亞砜（DMSO）（淄博博安公司），Transwell小室和基質(zhì)膠（美國Corning公司），UV-1900雙光束紫外分光光度計(jì)（上海美析公司），實(shí)時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織中miR-142表達(dá)：取組織，按試劑盒說明提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)對其純度開展檢測，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時熒光定量PCR儀按PCR擴(kuò)增試劑盒說明擴(kuò)增引物，序列：miR-142：上 游：5’-CGCGCCTGTAGTGTTTC CTACTTT-3’，下游：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAG GTA-3’；U6：上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATA CTAAAAT-3’，下游：5’-TTCACGAATTTGAGTGTC AT-3’。條件：94℃3 min，94℃30 s，65℃20 s，72℃30 s，36個循環(huán)，用2-△△Ct法計(jì)算RB和癌旁組織中miR-142表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)：使用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10g/dl胎牛血清和青-鏈霉素雙抗）在37℃，含5ml/dl CO2條件下培養(yǎng)Y79。待融合度在80%以上時，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑對對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染：①miR-142模擬物組：轉(zhuǎn)染miR-142模擬序列：正義鏈：5’-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3’，反義鏈：5’-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3’；②陰性對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列：正義鏈：5’-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-3’；③空白組：不作處理。處理后，各組培養(yǎng)48h。

1.3.3 檢測細(xì)胞中miR-142表達(dá)：收集各組轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞，其他操作步驟見1.3.1。

1.3.4 MTT實(shí)驗(yàn)：取不同組細(xì)胞，按每孔6×103個細(xì)胞接種在96孔板，37 ℃培養(yǎng)。分別在12 h，24 h，48 h，72 h和96 h時，各孔加入MTT液（5mg/ml）20 μl，孵育4h，除去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，室溫反應(yīng)10 min，利用酶標(biāo)儀對各孔吸光度A值檢測。重復(fù)操作3次。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞遷移：用胰酶消化各組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，離心，用無血清培養(yǎng)液按密度2.5×106/ml重懸細(xì)胞，在Transwell上室加入懸液200 μl，下室則加入600 μl含10g/dl胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽將散落細(xì)胞拭去，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲：用培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠，平鋪于小室上室，風(fēng)干，其它實(shí)驗(yàn)步驟同檢測細(xì)胞遷移。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，RB和癌旁組織中miR-142表達(dá)比較、不同臨床指標(biāo)間比較采用t檢驗(yàn)，三組細(xì)胞中miR-142表達(dá)、細(xì)胞增殖活性及遷移和侵襲力比較采用單因素方差分析和LSD多重檢驗(yàn)的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RB和癌旁組織中miR-142表達(dá)比較 RB組織中miR-142表達(dá)量（0.34±0.12）低于癌旁組織（0.99±0.16），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.102，P＜0.01）。

2.2 不同臨床指標(biāo)RB組織中miR-142表達(dá)比較 見表1。miR-142表達(dá)量在不同性別、年齡和眼側(cè)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而在不同分化程度、是否神經(jīng)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 miR-142在RB組織中表達(dá)量與臨床指標(biāo)相關(guān)性（±s）

表1 miR-142在RB組織中表達(dá)量與臨床指標(biāo)相關(guān)性（±s）

項(xiàng) 目 n miR-142表達(dá)量 t值 P值性別 男 48 0.33±0.12 1.262 0.211女31 0.36±0.11年齡（歲） ＜4 47 0.33±0.12 0.864 0.390≥4 32 0.36±0.13眼側(cè) 左側(cè) 42 0.36±0.13 1.274 0.207右側(cè) 37 0.32±0.11分化程度 未分化型 36 0.30±0.11 3.056 0.003分化型 43 0.38±0.12神經(jīng)浸潤 是 41 0.30±0.11 3.495 0.001否38 0.39±0.12淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是 31 0.29±0.11 2.991 0.004否48 0.37±0.12

2.3 三組細(xì)胞中miR-142表達(dá)比較 miR-142模擬物組、陰性對照組和空白組細(xì)胞中miR-142表達(dá)量分別為2.42±0.11，1.02±0.09，1.01±0.10，三組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=398.036，P＜0.01）；相比于陰性對照組和空白組，miR-142模擬物組細(xì)胞中miR-142表達(dá)量升高（P＜0.05）。

2.4 三組細(xì)胞增殖活性比較 見表2。相比于陰性對照組和空白組，miR-142模擬物組在24 h，48 h，72 h和96 h時吸光度A值均降低（P＜0.05）。

表2 三組細(xì)胞增殖活性比較（吸光度A值，±s）

表2 三組細(xì)胞增殖活性比較（吸光度A值，±s）

注：#與空白組比較，t=2.68, 3.37, 4.50, 3.99, 均P＜0.05；*與陰性對照組比較，t=3.28, 3.75, 3.48, 7.34,均P＜0.05。

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2.5 三組細(xì)胞遷移與侵襲力比較 見表3。相比于陰性對照組和空白組，miR-142模擬物組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.549, 5.237；7.724, 8.103, 均P＜0.05）。

表3 3組細(xì)胞遷移和侵襲力比較（±s，個）

表3 3組細(xì)胞遷移和侵襲力比較（±s，個）

項(xiàng) 目 miR-142模擬物組 陰性對照組 空白組 F值 P值遷移細(xì)胞數(shù) 107.83±3.54*# 129.50±7.29 131.83±6.74 28.394 ＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù) 96.00±5.87*# 116.17±7.39 120.17±4.36 27.982 ＜0.001

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）作為對兒童生命安全及視功能危害程度高且最為常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[9]。目前，臨床上對于RB的治療盡量保留眼球及視力，常采取的保守治療方法包括放療、化療、溫?zé)岑煼?、激光光凝治療等，但均存在一定的不良反?yīng)和（或）并發(fā)癥[10]，對于晚期的RB患者，手術(shù)摘除依然是最有效的治療手段[11]，但晚期RB患者預(yù)后依然較差，遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[12]，因此，亟需尋找更為有效且安全的治療方法。隨著分子靶向治療技術(shù)的成熟和應(yīng)用[13]，為RB的治療帶來了新的契機(jī)。miRNA作為廣泛存在于生物體內(nèi)的進(jìn)化上高度保守的短鏈RNA，通過與其靶基因互補(bǔ)配對而促使靶基因降解，從而實(shí)現(xiàn)對生物功能的調(diào)節(jié)[14]，研究表明[15]，miRNA參與調(diào)控了多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程，已被作為靶基因用于腫瘤分子治療。miR-142作為miRNA中的一員，已被發(fā)現(xiàn)參與了甲狀腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[16]，與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感度有關(guān)[17]。亦有研究[18]指出，miR-142-5p作為腫瘤抑制因子，通過抑制黏著斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase 9, MMP9）的表達(dá)，以及通過靶向PIK3CA的磷脂酰肌醇3-激酶/AKT信號通路來抑制胰腺癌的遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR-142在RB組織中表達(dá)量低于癌旁組織，說明RB組織中miR-142呈低表達(dá)，miR-142可能作為抑癌基因參與了RB發(fā)病。本研究結(jié)果顯示，miR-142表達(dá)量在未分化型、神經(jīng)浸潤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RB組織中明顯減少，miR-142可能參與了RB惡性進(jìn)展的臨床病理指標(biāo)有關(guān)，提示miR-142可能參與了RB惡性進(jìn)展。

為進(jìn)一步明確miR-142在RB發(fā)病中的作用，本研究采用轉(zhuǎn)染miR-142模擬物的方法觀察對人RB細(xì)胞株Y79的生物學(xué)功能的影響，結(jié)果顯示，miR-142模擬物組細(xì)胞中miR-142表達(dá)量高于陰性對照組和空白組，說明轉(zhuǎn)染模擬物后Y79細(xì)胞中miR-142表達(dá)量顯著升高，成功轉(zhuǎn)染。本研究顯示，相比于陰性對照組和空白組，24，48，72和96 h時miR-142模擬物組細(xì)胞吸光度A值均降低，說明miR-142可能與細(xì)胞增殖有關(guān)，在轉(zhuǎn)染模擬物后細(xì)胞增殖活性被顯著抑制。本研究結(jié)果表明，上調(diào)miR-142表達(dá)可顯著減少細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述，RB患者組織中miR-142表達(dá)量降低，且與分化程度、神經(jīng)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，上調(diào)miR-142表達(dá)可抑制Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，有望成為RB分子靶向治療新的靶位，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步開展相關(guān)研究予以明確。