膿毒癥患兒血漿miR-455-5p和miR-483-5p檢測(cè)的臨床應(yīng)用

鄧穎云，邱成英，吳日暖，匡曉玲，盧 磊（三亞市人民醫(yī)院兒科，海南三亞572000）

兒童膿毒癥(sepsis)是一種重度感染性疾病，可導(dǎo)致身體各個(gè)器官功能衰竭，其病情兇險(xiǎn)，病死率較高，是導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類新型的基因調(diào)控分子，參與全身炎癥反應(yīng)過(guò)程，對(duì)膿毒癥診斷及預(yù)后判斷具有較大的意義[2-3]。有報(bào)道指出，miR-455-5p及miR-483-5p在膿毒癥中異常表達(dá)，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，并可能是膿毒癥的潛在分子標(biāo)志物[4-5]。降鈣素原（procalcitonin，PCT）是一種反映炎癥反應(yīng)程度的有效指標(biāo)，可用于評(píng)價(jià)膿毒癥患者的嚴(yán)重程度、病情轉(zhuǎn)歸及療效監(jiān)測(cè)[6]。目前，關(guān)于miR-455-5p及miR-483-5p在膿毒癥中的臨床應(yīng)用價(jià)值尚未有報(bào)道，其能否作為膿毒癥診斷及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物尚未清楚。為此，本研究檢測(cè)膿毒癥患者血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平，分析其對(duì)兒童膿毒癥診斷及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，為兒童膿毒癥的診療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月～2020年12月三亞市人民醫(yī)院收治的108例膿毒癥患兒，其中男性66例，女性42例，年齡10個(gè)月～14（5.10±1.73）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤14歲，住院時(shí)間＞48 h；②符合兒童膿毒性休克(感染性休克)診治專家共識(shí)(2015版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在自身免疫疾病、血液病及惡性腫瘤者；②臨床資料不完整者及放棄治療者。根據(jù)膿毒癥患兒病情進(jìn)展情況，分為膿毒癥非休克組（65例）和膿毒癥休克組（43例）；根據(jù)膿毒癥患兒28天的生存情況，分為存活組（74例）和死亡組（34例）。同期收集50例健康兒童作為對(duì)照組，其中男性28例，女性22例；年齡1～14歲（5.24±1.65）歲。各組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 儀器與試劑 7500型熒光定量PCR儀，PCR相關(guān)試劑盒和Trizol試劑盒由上海生工生物工程公司提供。CL-2200i邁瑞全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 miR-455-5p及miR-483-5p檢測(cè)：采集3 ml肘靜脈血于EDTA抗凝管中，離心分離血漿。以 U6為內(nèi)參，使用熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-455-5p及miR-483-5p水平。反應(yīng)體系為20μl：10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1μl 引物及探針Mix（20×），1.33 μl反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7.67μl雙蒸餾水。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，55℃～60℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.2 PCT檢測(cè)：另采集研究對(duì)象靜脈血2 ml，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測(cè)PCT水平，參考范圍：0～0.05 μg/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用SNK-q檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平對(duì)膿毒癥診斷及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥休克組和非休克組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比較 見表1。與對(duì)照組比較，膿毒癥休克組和非休克組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平明顯升高（t=16.517，15.280，14.506，13.387，24.638，20.517，均P＜0.01），且膿毒癥休克組明顯高于非休克組（t=13.602，12.985，15.173，均P＜0.01）。

表1 膿毒癥休克組和非休克組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比較（±s）

表1 膿毒癥休克組和非休克組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比較（±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=50） 膿毒癥非休克組（n=65） 膿毒癥休克組（n=43） F值 P值miR-455-5p (2-△△Ct) 0.78±0.24 1.95±0.81 4.06±1.35 13.958 ＜0.01 miR-483-5p (2-△△Ct) 0.35±0.10 1.38±0.57 3.40±1.13 12.773 ＜0.01 PCT（μg/L） 0.02±0.01 5.73±2.36 19.97±9.12 16.170 ＜0.01

2.2 死亡組和存活組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，死亡組和存活組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平明顯升高（t=13.924，12.467，12.173，11.506，21.719，18.825，均P＜0.01），且死亡組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平均明顯高于存活組（t=12.162，10.513，13.874，，均P＜0.01）。

表2 死亡組和存活組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比較（±s）

表2 死亡組和存活組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平比較（±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=50） 存活組（n=74） 死亡組（n=34） F值 P值miR-455-5p (2-△△Ct) 0.78±0.24 1.74±0.68 4.30±1.52 15.718 ＜0.01 miR-483-5p (2-△△Ct) 0.35±0.10 1.20±0.45 3.61±1.24 13.904 ＜0.01 PCT（μg/L） 0.02±0.01 4.36±1.94 21.35±9.58 18.226 ＜0.01

2.3 血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平診斷膿毒癥的價(jià)值 見表3。血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平診斷膿毒癥的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.14，1.65，2.87μg/L，三項(xiàng)聯(lián)合診斷膿毒癥的曲線下面積（AUC）為0.904（95%CI：0.846～0.967），明顯高于單項(xiàng)miR-455-5p，miR-483-5p及PCT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其敏感度和特異度分別為92.4%和83.7%。

表3 血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平診斷膿毒癥的價(jià)值

2.4 血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平 預(yù)測(cè)膿毒癥患兒死亡的價(jià)值 見表4。血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平預(yù)測(cè)膿毒癥患兒死亡的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.92，2.35，14.16μg/L，三項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患兒死亡的AUC（0.928，95%CI：0.870～0.984）明顯高于單項(xiàng)miR-455-5p，miR-483-5p及PCT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其敏感度和特異度分別為94.7%和86.5%。

表4 血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平預(yù)測(cè)膿毒癥患兒死亡的價(jià)值

3 討論

兒童膿毒癥是由于宿主對(duì)感染的過(guò)度炎癥反應(yīng)而引起的一種嚴(yán)重綜合征，盡管最近的治療取得了進(jìn)展，但死亡率仍然很高。膿毒癥的非特異性臨床特征和延遲診斷一直是人們關(guān)注的問(wèn)題，目前尚無(wú)決定性的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物。由于miRNA具有高度的敏感度和準(zhǔn)確度，因此它被廣泛應(yīng)用于治療學(xué)等個(gè)性化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。越來(lái)越多的研究表明，膿毒癥患者外周血中miRNA表達(dá)水平可在一定程度上反映機(jī)體炎癥情況，同時(shí)還可判定疾病嚴(yán)重程度，有望成為膿毒癥早期診斷及預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p和miR-483-5p作為小分子RNA家族中的成員，可以參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的通路，影響炎性因子的產(chǎn)生，在調(diào)控嚴(yán)重炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用[9-10]。PCT是降鈣素的前肽物質(zhì)，是鑒別細(xì)菌感染和病毒感染的良好指標(biāo)，在嚴(yán)重細(xì)菌感染和膿毒癥中顯著升高，對(duì)膿毒癥的早期診斷和指導(dǎo)臨床抗生素使用具有較大幫助[11-12]。

本研究顯示，膿毒癥休克組血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平明顯高于膿毒癥非休克組，而且死亡組明顯高于存活組，說(shuō)明血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平升高與膿毒癥患兒的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。分析其原因可能是死亡患兒的全身炎癥反應(yīng)比較嚴(yán)重，引起大量炎癥因子釋放，病情無(wú)法得到有效控制，miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平顯著升高；而存活患兒病情比較穩(wěn)定，炎癥反應(yīng)程度降低，miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平呈下降趨勢(shì)。因此，血漿miR-455-5p，miR-483-5p及PCT水平呈明顯升高的膿毒癥患兒，病情較為嚴(yán)重，臨床上應(yīng)及時(shí)采取有效的治療措施，以最大限度地減少膿毒癥患兒的死亡情況。葉榮宗等[13]研究認(rèn)為，miRNA異常表達(dá)與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)，在膿毒癥發(fā)病機(jī)制、診斷和靶向治療中發(fā)揮較大的作用。ZHAO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者miRNA表達(dá)水平明顯升高，而且與疾病嚴(yán)重程度、器官功能損害及病死率明顯相關(guān)，可以作為評(píng)估膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的一個(gè)有用的生物學(xué)指標(biāo)。另有研究表明，血漿PCT水平在不同嚴(yán)重程度膿毒癥患兒中存在明顯差異，兒童膿毒癥的顯著發(fā)病率和死亡率有關(guān)，PCT水平檢測(cè)可用于兒童膿毒癥的早期識(shí)別，風(fēng)險(xiǎn)分層、預(yù)測(cè)和/或抗生素決策指導(dǎo)[11]。

本研究ROC曲線顯示，miR-455-5p和miR-483-5p聯(lián)合PCT對(duì)膿毒癥診斷及預(yù)測(cè)死亡的曲線下面積最大，其敏感度和特異度較好。提示miR-455-5p和miR-483-5p對(duì)兒童膿毒癥診斷及預(yù)后評(píng)估具有一定的價(jià)值，聯(lián)合PCT檢測(cè)可彌補(bǔ)單項(xiàng)檢測(cè)的不足，并有助于提高膿毒癥診斷及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。KARAM等[15]研究認(rèn)為，miRNA表達(dá)水平與膿毒癥患兒的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，對(duì)預(yù)測(cè)膿毒癥患兒的預(yù)后具有較好的臨床價(jià)值。RAHMEL等[16]研究表明，miRNA表達(dá)水平升高與膿毒癥患者病情嚴(yán)重和預(yù)后不良相關(guān)，是判斷膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，可能為膿毒癥基因水平治療提供新的思路。既往的研究也證實(shí)，PCT作為一種新的炎癥指標(biāo)，對(duì)膿毒癥的診斷和指導(dǎo)治療方案等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值，是目前診斷膿毒癥最有效、最可靠的常用標(biāo)志物[17]。

綜上所述，血漿miR-455-5p和miR-483-5p表達(dá)水平在膿毒癥患兒中明顯升高，其高表達(dá)與膿毒癥患兒的病情嚴(yán)重程度及死亡相關(guān)，聯(lián)合PCT檢測(cè)有助于提高兒童膿毒癥的診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值，同時(shí)也為膿毒癥患兒的靶向治療提供新的思路。PCT作為膿毒癥診斷的特異性指標(biāo)已得到臨床廣泛推廣，但miR-455-5p和miR-483-5p在膿毒癥中的應(yīng)用處于初步探索階段，仍需要更多的臨床前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證，為膿毒癥的診斷帶來(lái)更多的可靠標(biāo)志物。