子癇前期孕婦HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性和血清HIF-1a及VEGF水平表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

馮 健，凌秀婷，施俊柱，劉國棟，鐘偉傳

（1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518110；2.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518109）

子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期特有的一種疾病，主要表現(xiàn)為高血壓和蛋白尿，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，有研究認(rèn)為，可能與胎盤微血管缺氧有關(guān)[1-2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）是存在于多種細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，缺氧情況下可上調(diào)促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，HIF-1a基因多個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)性，且與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[3]，但與PE的發(fā)生是否有關(guān)未見報(bào)道。而VEGF是HIF-1a調(diào)節(jié)的一種下游因子，主要由滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種促血管生成因子。有研究表明，VEGF在促進(jìn)血管生成和維持血管內(nèi)皮功能等方面發(fā)揮著重要的作用，但其在PE孕婦中的表達(dá)仍存在很大爭議[4-6]。為此，本研究對深圳市龍華區(qū)PE孕婦和非PE健康孕婦HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性和HIF-1a及VEGF水平表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行了對比分析，探討其在PE發(fā)病中的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月～2021年3月在深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院和人民醫(yī)院婦產(chǎn)科確診的PE孕婦103例作為PE組，年齡22～45（31.65±9.72）歲；孕周21～36（28.01±6.34）周。其中輕度PE孕婦61例，重度PE孕婦42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）發(fā)布的《妊娠期高血壓和子癇前期指南（2019版）》中PE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②孕周≥20周；③產(chǎn)檢規(guī)律及資料完整者；④單胎者；⑤自愿參與并積極配合者；⑥患者及家屬知情同意者；⑦經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有實(shí)質(zhì)器官性、免疫性及血液性等基礎(chǔ)疾病者；②伴有慢性高血壓、心臟病、肝病、腎病及糖尿病者；③多胎者；④甲狀腺功能異常者；⑤有免疫治療史者。同時(shí)選取非PE健康孕婦120例作為對照組，年齡20～47（30.92±10.25）歲；孕周20～38（28.76±7.05）周，體檢均未見明顯異常。兩組年齡、孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 HIF-1a和VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（上海科順生物科技有限公司），DNA提取試劑盒（深圳亞能生物科技公司），ABI7500 PCR基因擴(kuò)增儀（美國ABI公司），AE275酶聯(lián)免疫吸附儀（深圳愛康公司）。

1.3 方法

1.3.1 HIF-1a和VEGF水平檢測：采集靜脈血3.0～5.0ml，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對HIF-1a和VEGF水平進(jìn)行檢測，操作按儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 DNA提?。撼槿?.0～3.0ml靜脈血于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，上下顛倒充分混勻后，采用DNA提取試劑盒提取全血組DNA，并將合格的DNA提取物置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HIF-1a基因rs11549467 G/A位點(diǎn)多態(tài)性分析：利用限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)（restriction fragment length polymor-phism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR）技 術(shù) 對HIF-1a基因第12外顯子rs11549467 G/A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，具體操作參照文獻(xiàn)[8]。①引物設(shè)計(jì)：上游引物：5’-AAGGTGTGGCCATTGTA AAAACTC-3’，下游引物：5’-TGACTCAAAGCGAC AGATAAC ACG-3’；②反應(yīng)體系：總體積50μl，其中10×緩沖液5.0μl，dNTP 1.0μl，上、下游引物各0.5μl ，0.1μg/μl DNA模板1.0μl ，1U/μl Taq DNA聚合酶 0.5μl，加雙蒸水至50.0μl ；③擴(kuò)增：94℃預(yù)變性2 min，然后以94℃變性30s→56℃退火1.0min→72℃延伸1min，反復(fù)循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；④酶切：取聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物10.0μl，Aci I內(nèi)切酶液2.0μl及去離子水7.5μl，60℃酶切1.0h；⑤電泳：取擴(kuò)增產(chǎn)物于2g/dl瓊脂糖凝膠上電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0進(jìn)行分析。計(jì)量結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異；計(jì)數(shù)結(jié)果以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)比較兩組間差異；遺傳平衡采用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)；采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HIF-1a和VEGF水平比較 PE組HIF-1a水平（23.92±5.06pg/ml）明顯高于對照組（4.98±1.32pg/ml），而VEGF水平（86.37±20.64pg/ml）明顯低于對照組（195.18±35.21pg/ml），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.054 2，P=0.013 7；t=9.147 5，P=0.028 1）。

2.2 不同程度PE孕婦HIF-1a和VEGF水平比較 重度PE孕婦HIF-1a水平（40.86±6.25pg/ml）明顯高于輕度PE孕婦（12.06±2.93pg/ml），而VEGF水平（132.84±27.52pg/ml）明顯低于輕度PE孕婦（285.72±41.37pg/ml），不同程度PE孕婦差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.631 5，P=0.031 9；t=7.194 3，P=0.025 2）。

2.3 電泳圖 見圖1。PE組和對照組HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)SNP均出現(xiàn)GG，GA和AA 三種基因型，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.049 2，P=0.069 5），表明抽樣具有代表性。

圖1 HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)電泳圖

2.4 兩組HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性比較 見表1。PE組HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)AA基因型和A等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.374 5，4.826 7，均P＜0.05）。

表1 兩組HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性比較[n（%）]

2.5 不同程度PE孕婦HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性比較 見表2。重度PE孕婦HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)AA基因型和A等位基因頻率明顯高于輕度PE孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.208 6，4.619 7，均P＜0.05）。

表2 不同程度PE孕婦HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性比較 [n（%）]

2.6 不同基因型PE孕婦HIF-1a水平比較 HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)AA基因型PE孕婦HIF-1a水平（37.96±8.13pg/ml）明顯高于GG和GA基因型（15.29±2.45 pg /ml和16.38±2.93 pg/ml），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.904 2，6.157 6，P=0.032 4，0.034 1），而GG和GA基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.914 5，P=0.071 8）。

2.7 HIF-1a和VEGF水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，PE組HIF-1a水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（r=0.617 4，P=0.035 9），而VEGF水平與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.691 3，P=0.0311）。

3 討論

子癇前期（PE）的基本病理變化為血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、全身細(xì)小動(dòng)脈痙攣，全身各系統(tǒng)灌流減少，從而導(dǎo)致全身多器官功能損傷，嚴(yán)重威脅母嬰健康，其發(fā)病率約為2.0%～8.0%，且約15%的早產(chǎn)是由PE引起，約有10.0%～15.0%的孕產(chǎn)婦死于PE，是導(dǎo)致早產(chǎn)、新生兒患病及孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[9-10]。但PE病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未闡明，同時(shí)PE的發(fā)生和進(jìn)展毫無先兆，且不同患者的臨床表現(xiàn)、進(jìn)展及結(jié)局各異，給早期診斷、治療及預(yù)防造成很大困難。因此，及早預(yù)測和識(shí)別高危者，并及時(shí)采取干預(yù)措施，對有效降低其發(fā)病率和死亡率有重要的臨床意義是缺氧情況下缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)錄過程中的一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，PE患者胎盤血管發(fā)生不同程度痙攣，導(dǎo)致其血流減少，造成胎盤局部組織缺血和缺氧，從而增加細(xì)胞內(nèi)HIF-1a表達(dá)水平，以便提高組織對缺氧的耐受能力[11-13]。本研究結(jié)果顯示，PE孕婦血清HIF-1a水平明顯升高，以重度PE孕婦升高更為明顯，且與PE病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這表明HIF-1a表達(dá)與PE的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。同時(shí)也說明了PE發(fā)生和發(fā)展過程中孕婦胎盤組織可能存在不同程度缺血、缺氧情況，這對PE的病因及發(fā)病機(jī)制的研究提供重要的參考依據(jù)。

VEGF是HIF-1a調(diào)節(jié)的一種下游因子，其基因轉(zhuǎn)錄受HIF-1a水平的調(diào)節(jié)，其在PE孕婦中的水平表達(dá)雖存在很大爭議，但可通過不同途徑誘導(dǎo)和促進(jìn)PE甚至高血壓的發(fā)生。有研究認(rèn)為，PE患者胎盤缺血、缺氧可引起HIF-1a表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致VEGF水平增加，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，增加血管通透性，導(dǎo)致高血壓。但也有研究表明，VEGF主要由胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分泌，胎盤組織缺血、缺氧可引起炎性因子及其代謝產(chǎn)物釋放增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致其水平降低，影響滋養(yǎng)細(xì)胞分化、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和侵襲能力下降及發(fā)育受阻，從而進(jìn)一步加重胎盤缺血缺氧性損傷，誘導(dǎo)和促進(jìn)PE的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程[14-16]。本研究結(jié)果顯示，PE孕婦血清中VEGF水平明顯降低，以重度PE孕婦降低更為明顯，且與PE病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，這可能與PE發(fā)病中炎性細(xì)胞因子及其產(chǎn)物釋放增加導(dǎo)致VEGF濃度降低的作用大于HIF-1a對VEGF水平表達(dá)上調(diào)的作用有關(guān)，從而互相作用進(jìn)一步促進(jìn)PE發(fā)生和發(fā)展。

有研究表明，PE發(fā)病與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、免疫異常、血管內(nèi)皮損傷、營養(yǎng)及遺傳等多種因素有關(guān)，是一種多因素、多基因性疾病，其中基因突變在其發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。HIF-1a是在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的一種轉(zhuǎn)錄因子，其基因位于14q21～24，由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，其基因多個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)性，且與多種疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[17-19]。本研究結(jié)果顯示，PE孕婦HIF-1a基因rs11549467 G/A位點(diǎn)AA基因型和A等位基因頻率明顯升高，且以重度PE孕婦升高更為明顯，這表明PE的發(fā)生和發(fā)展與HIF-1a基因rs11549467 G/A位點(diǎn)多態(tài)性有一定的相關(guān)性，其中AA基因型可能是深圳地區(qū)PE發(fā)病的易感基因。另外，AA基因型PE孕婦HIF-1a水平明顯高于其它基因型，這表明其基因多態(tài)性可能通過影響其蛋白水平表達(dá)而在PE中發(fā)揮作用的。

綜上所述，PE孕婦HIF-1a水平明顯升高，而VEGF水平明顯降低，與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。同時(shí)PE孕婦HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)存在多態(tài)性，且不同基因型孕婦血清HIF-1a水平存在很大差異。因此，HIF-1a，VEGF水平表達(dá)及HIF-1a基因rs11549467G/A位點(diǎn)多態(tài)性可能與PE的發(fā)生和發(fā)展有一定相關(guān)性。