升陽益胃湯對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸及下丘腦組織5-HT含量的影響

畢珺輝，楊悅，楊育同，陳宜瑤，舒曉葳，馮玉華*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030000)

腸易激綜合征(Diarrhea Irritable Bowel Syndrome，IBS-D)是一種功能性胃腸道疾病，其癥狀是反復(fù)腹痛并伴有大便性狀及排便頻率的改變，腸易激綜合征的病因尚未明確，但“腦-腸軸”功能紊亂會導(dǎo)致內(nèi)臟高敏反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，這可能是導(dǎo)致腸易激綜合征的原因之一[1]。腦腸肽是一種在腦和胃腸道中雙重分布的肽類，是連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的橋梁，也是“腦-腸軸”信號傳導(dǎo)功能實現(xiàn)的重要基礎(chǔ)。5-羥色胺是腦腸肽中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其含量變化與腸易激綜合征的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認為脾失健運，運化失司，水液輸布不暢則易產(chǎn)生濕濁痰瘀；水谷精微運化不及則有食積，氣機不暢，則會導(dǎo)致腸道功能紊亂。升陽益胃湯來源于李杲之《內(nèi)外傷辨惑論》，乃補中益氣湯以白芍易當(dāng)歸、防風(fēng)易升麻，再加茯苓、半夏、羌活、獨活、澤瀉、黃連而成，較之補中益氣湯在補氣升陽之中又增除濕清熱之效，故宜于脾胃虛弱，清陽不升，濕郁生熱之證。本實驗通過構(gòu)建腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型，觀察各組大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT的含量變化，探討升陽益胃湯對IBS-D大鼠5-HT含量的影響，從而為升陽益胃湯之藥物運用提供一定的實驗依據(jù)。

1 主要材料及儀器

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2018-003，給予充足飲食及飲水，在標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 藥物與試劑

升陽益胃湯中藥飲片(黃芪、半夏、人參、甘草、獨活、防風(fēng)、白芍、羌活、橘皮、茯苓、柴胡、澤瀉、白術(shù)、黃連)及番瀉葉購于北京同仁堂;匹維溴銨(批號：713056，規(guī)格50 mg/片，MYLAN LABORATORIES SAS)；RAT 5-HT ELISA KIT 96Tests酶聯(lián)免疫試劑盒(Biotopped Cat No.EL02905 Lot:2021/08);無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);HE染液套裝(Servicebio);中性樹膠(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 主要儀器

洗板機(芬蘭Thermo Labsystems，儀器型號：AC8);酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS，儀器型號：352型);離心機(微量高速離心機，儀器型號：TG16W);培養(yǎng)箱(隔水式恒溫培養(yǎng)箱，儀器型號：GNP-9080型);脫水機(DIAPATH);包埋機(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);凍臺(武漢俊杰電子有限公司);組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);染色機(DIAPATH);烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司);載玻片(Servicebio);正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)、成像系統(tǒng)(日本尼康)。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 升陽益胃湯中藥飲片制備

升陽益胃湯中藥飲片依照原方用法用量磨成粗粉，加8倍水，將藥物用紗布包裹煎煮30 min后過濾藥液，濃縮成1.35 g/kg、2.7 g/kg、5.4 g/kg的藥液，于4 ℃冰箱中存放備用[2]。

2.1.2 匹維溴銨陽性對照藥制備

將匹維溴銨片碾碎，加蒸餾水配制成0.018 g/kg的藥液，放入4 ℃冰箱中備用。

2.1.3 番瀉葉的制備

番瀉葉粗粉中加入8倍100 ℃水浸泡30 min，濾出藥液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至0.45 g/mL[3-4]。

2.2 IBS-D動物模型復(fù)制

每日9∶00 am，除空白組外，其余大鼠均用0.45 g/mL濃度的番瀉葉浸出液進行灌胃給藥，灌胃量為10 mL/kg，灌胃1 h后，使用6.5 cm寬的醫(yī)用膠帶自大鼠前胸起纏繞一周以固定其前爪及項后背部，從而束縛大鼠，使大鼠前肢不能隨意活動，抓撓面部，但不妨礙大鼠正常走動，在大鼠束縛過程中，保證其始終處于束縛狀態(tài)，若掙脫束縛，則立即重新用醫(yī)用膠帶固定，束縛時間持續(xù)1 h，束縛的同時使用夾尾夾夾尾刺激，刺激持續(xù)15 min，刺激結(jié)束后，將各組大鼠分別放回鼠籠，保證飲水及食物充足，造模持續(xù)2周，造模過程中對大鼠一般情況進行觀察[5-6]。

2.3 實驗動物分組及給藥

造模成功后，將模型組大鼠按照隨機數(shù)字表法[7-8]分為模型組、升陽益胃湯高劑量組、升陽益胃湯中劑量組、升陽益胃湯低劑量組、陽性藥對照組，另設(shè)空白組，每組10只。造模結(jié)束后于每日固定時間進行灌胃給藥，連續(xù)給藥2周，模型組及空白組給予等體積的生理鹽水。

2.4 樣本采集

樣本采集前禁食不禁水18 h，末次給藥后1 h用水合氯醛麻醉大鼠，選取大鼠遠端結(jié)腸約2 cm，將其一分為二，一份置于液氮中保存，另一份于4%多聚甲醛中存儲。斷頭取腦，在冰盤上剝離出下丘腦，放入液氮中暫存。液氮中的組織隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

2.5 大鼠一般情況觀察

實驗開始后觀測大鼠精神狀態(tài)，皮毛顏色、進食飲水、排便等一般情況，并于造模前、給藥前、給藥后測量大鼠體質(zhì)量。

2.6 腹壁撤退反射

參照AWR評分標(biāo)準(zhǔn)，給藥結(jié)束后對大鼠進行內(nèi)臟敏感性評價。測量腹壁撤退反射前18 h禁食不禁水，用大小合適的透明容器限制大鼠運動。

(1)準(zhǔn)備血壓計、5 mL注射器，將注射器與血壓計連接，用注射器向血壓計內(nèi)注氣，記下80 mmHg、60 mmHg、40 mmHg、20 mmHg不同壓力下注射器對應(yīng)刻度。

(2)將注射器與兒童用8F導(dǎo)尿管相連，導(dǎo)尿管中用注射器注氣，達到相應(yīng)刻度時，壓強為導(dǎo)尿管前端球囊內(nèi)的壓力。

(3)導(dǎo)尿管涂上石蠟油以保持潤滑，從大鼠肛門插入約6 cm，在大鼠肛門外1 cm處，將導(dǎo)尿管與大鼠尾根部用醫(yī)用膠帶固定在一起。然后將大鼠放在透明容器中，待其保持平靜狀態(tài)一段時間后，用注射器向?qū)蚬軆?nèi)充氣，隨著壓力的不斷增強，觀察每只大鼠的腹壁對8F導(dǎo)尿管前端氣囊擴張刺激的反應(yīng)程度。

每只大鼠測3次，每次間隔5 min[9]。評分標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在不同壓力刺激下的反應(yīng)程度：0分，對刺激無明顯行為反應(yīng)；1分，身體保持不動，但頭部出現(xiàn)短暫運動；2分，腹部肌肉未離底面，但呈收縮狀態(tài)；3分，腹部肌肉抬離底面，腹肌收縮；4分，身體呈弓形狀態(tài)，骨盆抬起[3]。

2.7 ELISA法測定大鼠結(jié)腸、下丘腦中5-HT含量

于-80 ℃冰箱中將組織取出，室溫下解凍，用PBS沖洗干凈后，用濾紙吸干多余液體，將組織剪碎，在冰浴條件下，用勻漿機將組織進一步粉碎，勻漿液離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明測定大鼠結(jié)腸、下丘腦中5-HT的含量。

2.8 HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)

結(jié)腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，嚴格按照程序進行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片、鏡檢。在顯微鏡下瀏覽切片，在不同倍數(shù)下詳細觀察組織切片情況，對切片中基本病理改變?nèi)绯溲?、瘀血、出血、水腫、變性、壞死、增生、纖維化、機化、肉芽組織、炎性變化等情況進行觀察。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 升陽益胃湯對IBS-D大鼠體質(zhì)量的影響

空白組大鼠在實驗過程中，精神狀態(tài)良好，皮毛光澤順滑，進食飲水均保持正常水平。模型組大鼠在造模期間表現(xiàn)出攻擊性，反抗強烈，造模后精神狀況較差，對刺激敏感，經(jīng)常蜷縮抱團，進食、飲水與空白組相比有所減少。造模前，兩組大鼠體質(zhì)量相差不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后，模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，與空白組大鼠比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。造模前后各組大鼠體質(zhì)量變化見表1。

表1 造模前后各組大鼠體質(zhì)量變化

藥物干預(yù)前，各組大鼠體質(zhì)量與空白組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義；藥物干預(yù)后，陽性藥組及升陽益胃湯各劑量組大鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好，進食、飲水情況較藥物干預(yù)前有所好轉(zhuǎn)，模型組大鼠體質(zhì)量與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，陽性藥及升陽益胃湯各劑量組與模型組比較體質(zhì)量增長較快，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 藥物干預(yù)前后各組大鼠體質(zhì)量變化

3.2 腹壁撤退反射情況

藥物干預(yù)結(jié)束后，與模型組相比，升陽益胃湯高、中、低劑量組及陽性藥對照組在不同壓力下的腹壁撤退反射評分均有所下降。在20 mmHg壓力下，各給藥組腹壁撤退反射評分低于模型組，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.094>0.05)；球囊壓力在40 mmHg時，升陽益胃湯低劑量組的腹壁撤退反射評分低于模型組，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.053>0.05)。除此之外，在40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg壓力下，各給藥組的腹壁撤退反射評分均低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示各給藥組能夠有效減輕IBS-D大鼠的內(nèi)臟高敏情況，見表3。

表3 藥物干預(yù)后各組大鼠AWR評分變化分)

3.3 升陽益胃湯對IBS-D大鼠結(jié)腸及下丘腦5-HT的影響

模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT含量與空白組比較顯著升高(P<0.05)。各給藥組大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT含量與模型組比較顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 升陽益胃湯對IBS-D大鼠結(jié)腸及下丘腦5-HT含量的影響

3.4 升陽益胃湯對IBS-D大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

空白組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，各層組織結(jié)構(gòu)分明，上皮細胞無明顯變化，無異常病理學(xué)改變；模型組固有層腺體數(shù)量豐富，排列緊密，間質(zhì)可見較多淋巴細胞浸潤，無其他病理學(xué)改變；陽性對照組黏膜上皮完整，未見明顯的上皮細胞變性、壞死和脫落，間質(zhì)可見較多的淋巴細胞，部分淋巴管充滿淋巴細胞，黏膜下層和肌層未見明顯異常。升陽益胃湯低劑量組未見明顯的上皮細胞變性、壞死和脫落，底部杯狀細胞含量豐富，間質(zhì)可見少量的淋巴細胞；升陽益胃湯中劑量組固有層腺體數(shù)量豐富，排列緊密，間質(zhì)可見少量淋巴細胞，無其他病理學(xué)改變；升陽益胃湯高劑量組無異常病理學(xué)改變；固有層腺體數(shù)量豐富，排列緊密，間質(zhì)可見少量的淋巴細胞；各組大鼠結(jié)腸黏膜下層和肌層均未見明顯異常，無病理學(xué)改變，符合腹瀉型腸易激綜合征病理特點，見圖1。

注：A1、A2空白組；B1、B2模型組；C1、C2升陽益胃湯低劑量組；D1、D2升陽益胃湯中劑量組； E1、E2升陽益胃湯高劑量組；F1、F2陽性對照組。圖1 各組大鼠對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響

4 討論

腸易激綜合征是一種慢性功能性胃腸道疾病，其特征是腹痛、排便習(xí)慣改變、腹瀉或便秘，但在顯微鏡觀察下無器質(zhì)性病變，雖然IBS為非致命性疾病，但由于其具有難治愈、易復(fù)發(fā)的特點，IBS仍然給患者日常生活帶來巨大影響。有研究指出，患有腸易激綜合征的人群會嚴重影響生活質(zhì)量，降低工作效率，更容易產(chǎn)生疲勞感[11-12]。IBS的病因還未明確，但腸-腦互動異常、內(nèi)臟高敏感性、胃腸道動力異常、腸道低度炎癥等是其可能的發(fā)病機制[10]。現(xiàn)代研究認為[13]，“腦-腸軸”間的雙向信號傳導(dǎo)失調(diào)是致病機制之一?！澳X-腸軸”雙向信號傳導(dǎo)失調(diào)，由神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫因素介導(dǎo)，并由心理社會因素調(diào)節(jié)，共同成為了IBS發(fā)生發(fā)展的重要因素?！澳X-腸軸”的信號傳導(dǎo)離不開腦腸肽，腦腸肽是一類小分子的肽類物質(zhì)，同時分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸神經(jīng)系統(tǒng)，由于腦腸肽雙重分布的特性，腦-腸之間實現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸效應(yīng)細胞之間的信號傳導(dǎo)。5-HT廣泛分布于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮重要作用。5-HT系統(tǒng)功能障礙會導(dǎo)致胃腸動力異常及內(nèi)臟敏感性增加，5-HT濃度升高時會增加腸道蠕動頻率和內(nèi)臟敏感性[14-15]。

中醫(yī)認為IBS的發(fā)病與情志失調(diào)、飲食不節(jié)、感受外邪密切相關(guān)，病位在腸，與肝、脾(胃)等臟腑相關(guān)。脾主運化水濕，脾虛納運乏力，水液輸布不暢則會產(chǎn)生濕濁痰瘀；水谷精微運化不及，則飲食不化而形成食積；氣機不暢則致腸道功能紊亂；肝失疏泄，橫逆犯脾，脾氣不升則有泄瀉；腑氣通降不利則有腹痛、腹脹。

升陽益胃湯來源于李杲之《內(nèi)外傷辨惑論》，乃補中益氣湯以白芍易當(dāng)歸、防風(fēng)易升麻，再加茯苓、半夏、羌活、獨活、澤瀉、黃連而成。加茯苓、澤瀉、半夏，以助除濕和胃之效；加羌活、獨活，可祛浸淫肌肉筋骨之濕；加黃連，能清中焦之濕熱；用白芍，以其既有當(dāng)歸養(yǎng)血之能，又因酸收而可防諸辛散藥耗氣之虞；用防風(fēng)，取其既有升麻升發(fā)脾氣之功，又兼祛風(fēng)勝濕之用，較之補中益氣湯在補氣升陽之中又增除濕清熱之效，故宜于脾胃虛弱，清陽不升，濕郁生熱之證。

實驗結(jié)果表明升陽益胃湯各劑量組均可提高IBS-D大鼠體質(zhì)量，改善腹瀉癥狀，降低內(nèi)臟敏感性，保護IBS-D大鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)，降低IBS-D大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT的含量，其作用呈劑量依賴性。其中，升陽益胃湯高劑量組效果優(yōu)于各給藥組，其作用機制可能是通過降低結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT的含量從而改善腦腸肽的異常分泌，使“腦-腸軸”信號傳導(dǎo)功能恢復(fù)正常、內(nèi)臟敏感性降低而實現(xiàn)的。但5-HT是獨自發(fā)揮作用還是與其他胺類介質(zhì)如腎上腺素、多巴胺發(fā)生拮抗或激動作用仍需進一步研究。