RT-qPCR分析拷貝數(shù)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平對表達(dá)左聚糖蔗糖酶的影響

陳碩昌，仝秋平，郭曉磊，朱 萍，蒙健宗，楊 輝，3

（1.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；3.廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004）

左聚糖是一種果聚糖，主鏈主要由呋喃果糖殘基以β-（2,6）糖苷鍵連接形成，支鏈由少量β-（2,1）糖苷鍵連接形成。左聚糖通常由微生物生產(chǎn)，分子質(zhì)量多為105～107Da，植物生產(chǎn)的左聚糖含量低且分子質(zhì)量一般較小[1]。在食品工業(yè)中，由于左聚糖有良好的水溶性、高分子質(zhì)量和低黏度等特性，所以可用作乳化劑、穩(wěn)定劑和增稠劑[2]。在制藥工業(yè)中，左聚糖可用作血漿擴(kuò)容劑、減肥劑和降膽固醇劑等[3]。此外，由于左聚糖具有保濕性質(zhì)、低細(xì)胞毒性、促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞增殖和抗炎作用，還可用于化妝品中[4]。目前左聚糖的制備主要分為直接提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵和酶法合成四種，其中酶法合成左聚糖操作簡單，純化方便，對工業(yè)生產(chǎn)中有著廣闊的發(fā)展前景[5-6]。左聚糖蔗糖酶屬于GH68糖苷水解酶家族，同時具有水解蔗糖和轉(zhuǎn)果糖基的雙重活性。

與大腸桿菌（Escherichia coli）相比，畢赤酵母（Pichia pastoris）的安全性更好，已被認(rèn)定為一般公認(rèn)為安全（generally recongnized as safe，GRAS）微生物[7]。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前最有效、最方便、最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一[8-9]，其具有安全性好[10]、外源基因可穩(wěn)定存在[11]、可實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)和適合工業(yè)化生產(chǎn)[12]等優(yōu)點(diǎn)，畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)已在食品、醫(yī)藥和工業(yè)酶制劑[13]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。外源基因可以通過同源重組整合到畢赤酵母（Pichia pastoris）的基因組上，并且可以在同一位點(diǎn)多次同源重組從而插入多個拷貝。有研究表明，多拷貝菌株通常比單拷貝菌株表達(dá)更多的外源蛋白[14]，但是重組菌株外源蛋白表達(dá)量并不都是隨著拷貝數(shù)增加而增加[15-16]。目前關(guān)于利用酵母表達(dá)重組左聚糖蔗糖酶的報道較少，并且缺乏拷貝數(shù)對重組畢赤酵母（Pichia pastoris）左聚糖蔗糖酶分泌表達(dá)水平影響的相關(guān)研究。

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一種核酸定量技術(shù)[17]，可用于研究基因組學(xué)，與Southern印跡和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測序來鑒定擴(kuò)增子相比，RT-qPCR具有操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏和高通量等優(yōu)點(diǎn)[18]，已成為檢測信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的首選方法[19]。

本研究采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法RT-qPCR技術(shù)，以畢赤酵母（Pichia pastoris）的持家基因gap為內(nèi)參，通過SYBR Green模式的RT-qPCR測定重組畢赤酵母中左聚糖蔗糖酶基因SacB[6]的基因拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄水平，意在探究不同基因拷貝數(shù)及相應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化對重組畢赤酵母分泌表達(dá)左聚糖蔗糖酶的影響，為篩選高效表達(dá)的重組菌株提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）trans10：北京全式金生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115：美國Invitrogen公司；含不同SacB基因拷貝數(shù)的畢赤酵母菌株：由本實(shí)驗(yàn)室前期將含SacB基因的質(zhì)粒pPIC9K通過氯化鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115所得；pMD19-T Vector：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.1.2 主要試劑

酵母基因組DNA（genome DNA，gDNA）提取試劑盒、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）、生物素（vitamin H，VH）（純度＞99%）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranoside，X-gal）（純度＞99%）：北京索萊寶科技有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式膠回收試劑盒：上海生工生物技術(shù)有限公司；酵母RNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ultra SYBR Mixture：康為世紀(jì)生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（純度＞98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸出粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；葡萄糖20.0 g/L，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

含有甘油的緩沖性完全（buffered minimal glycerol YP medium，BMGY）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L，0.1 mol/L磷酸鹽鉀緩沖液（0.1 mol/L K2HPO4與0.1 mol/L KH2PO4混合調(diào)節(jié)pH=6.0）100 mL/L，10%（V/V）甘油100 mL/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；13.4%YNB 100 mL/L，0.2 mg/mL生物素2 mL/L，0.22 μm孔徑無菌濾膜過濾除菌。

含有甲醇的緩沖性完全（buffered minimal methanol YP medium，BMMY）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L，0.1 mol/L磷酸鹽鉀緩沖液（0.1 mol/L K2HPO4與0.1 mol/L KH2PO4混合調(diào)節(jié)pH=6.0）100 mL/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；13.4%YNB 100 mL/L，0.2 mg/mL生物素2 mL/L，5%（V/V）甲醇100 mL/L，0.22 μm孔徑無菌濾膜過濾除菌。

藍(lán)白斑篩選（blue-white screening，BWS）培養(yǎng)基[20]：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂粉15g/L，121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min；氨芐青霉素100 mg/mL，X-gal 24 μg/mL，IPTG 24 μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDropTMOne微量核酸定量儀：賽默飛世爾科技（中國）公司；LightCycler480 II實(shí)時熒光定量PCR儀：瑞士ROCHE公司；PTC-2000 PCR儀：美國MJ Research公司；SKY-211B恒溫?fù)u床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-25 pH計(jì)：上海金邁儀器儀表有限公司；LDZX-50FBS滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1601紫外分光光度計(jì)：上海市第三分析儀器廠；Avanti J-E、Microfuge 20低溫離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫公布的畢赤酵母gap基因序列（U62648）設(shè)計(jì)GAP引物gap-1和gap-2，根據(jù)重組畢赤酵母菌株的SacB基因序列設(shè)計(jì)SacB引物SacB-1和SacB-2見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列Table 1 The primer sequences used in the experiments

1.3.2 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

接種GS115、重組畢赤酵母，分別提取GS115和重組畢赤酵母的gDNA。以GS115的gDNA為模板，PCR擴(kuò)增gap基因片段；以重組畢赤酵母的gDNA為模板，PCR擴(kuò)增SacB基因片段。回收gap和SacB片段后分別連接到pMD19-TVector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后涂布于藍(lán)白斑篩選平板過夜培養(yǎng)。挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性克隆送往北京六合華大基因科技有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒作為RT-qPCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，分別命名為T-gap和T-SacB。

1.3.3 待測樣品的制備

接種重組畢赤酵母于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值=1.0，用酵母基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。

接種重組畢赤酵母于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值=2.0～6.0，后，以1%（V/V）接種量接種至BMGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值=15～20，離心收集菌體后轉(zhuǎn)移至BMMY液體培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min誘導(dǎo)產(chǎn)酶，每24 h添加1%（V/V）甲醇。分別在誘導(dǎo)時間為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取樣，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄制備合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）樣品。cDNA反應(yīng)體系共20 μL，其中含Anchored Oligo（dT）18Primer（0.5 μg/μL）1 μL，模板RNA 50 ng～5 μg，2×TS Reaction Mix 10 μL，TranscripRT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover1μL，補(bǔ)足無酶無菌水（RNase-Free Water）至20 μL。將RNA模板、引物與RNase-free water混勻，65 ℃孵育5 min后冰浴2 min，再加入其他組分；42 ℃孵育15 min；85 ℃，5 s失活處理。

1.3.4 RT-qPCR擴(kuò)增體系及程序

PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：含引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）8.5 μL，2×Ultra SYBR Mixture 10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。熔解曲線分析程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

1.3.5gap和SacB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒分別從構(gòu)建好含有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的菌株抽提T-gap和T-SacB，用微量核酸測定儀測定濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)：（6.02×1023）×（g/mL）/（DNA堿基長度×660）=拷貝數(shù)/mL。分別以1 μL不同稀釋度質(zhì)粒溶液（103、104、105、106、107個拷貝數(shù)/μL）作為模板，以RTgap-1/RTgap-2和RTSacB-1/RTSacB-2引物進(jìn)行RT-qPCR，每個濃度檢測3次。以Ct值（y）作為縱坐標(biāo)，起始模板中質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值（x）作為橫坐標(biāo)，建立GAP和SacB基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]。通過運(yùn)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以分析目的基因的相對含量[22]。

1.3.6SacB基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄水平的檢測

檢測SacB基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄水平時，分別以重組畢赤酵母的gDNA樣品及其不同發(fā)酵階段的cDNA樣品為模板，分別用引物RTgap-1/RTgap-2和RTSacB-1/RTSacB-2進(jìn)行RT-qPCR檢測，每個樣品檢測3次。gap基因在畢赤酵母的基因組中以單拷貝的形式存在[23]，因此SacB基因在畢赤酵母基因組中的起始拷貝數(shù)為SacB與gap基因拷貝數(shù)的比值。檢測重組畢赤酵母轉(zhuǎn)錄水平時，采用樣品mRNA含量對內(nèi)參進(jìn)行相對定量檢測分析mRNA表達(dá)變化。

1.3.7 左聚糖蔗糖酶酶液的制備及酶活測定

胞外酶液的制備：發(fā)酵液低溫離心后的上清即為胞外粗酶液。

胞內(nèi)酶的制備：①4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，10 mL ddH2O清洗菌體1次，20 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）清洗菌體2次；②用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）重懸細(xì)胞至OD600nm值=50～100；③加入等體積的酸洗玻璃珠（0.5 mm），渦旋30 s，冰上孵育30 s，重復(fù)7次；④4 ℃、12 000 r/min離心10 min離心得上清即為胞內(nèi)粗酶液。

采用DNS法測定左聚糖蔗糖酶水解活力[5]。一分子蔗糖可水解成一分子果糖和一分子葡萄糖，實(shí)驗(yàn)所需測的是葡萄糖生成量，因此所測還原糖含量需乘1/2即為葡萄糖的真實(shí)生成量。左聚糖蔗糖酶酶活定義為：在最適pH、溫度條件下，1 min催化蔗糖轉(zhuǎn)化成1 μmol葡萄糖所需左聚糖蔗糖酶的量為1個酶活單位（U/mL）[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立gap和SacB基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

gap和SacB基因擴(kuò)增及熔解曲線見圖1。由圖1可知，gap和SacB基因的擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，有明顯的指數(shù)增長期，擴(kuò)增效率較高，符合定量檢測要求；熔解曲線均只有一個單一峰，表明PCR產(chǎn)物中無非特異性產(chǎn)物，證明RTqPCR的兩對引物具有較好的特異性。gap和SacB基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由圖2可知，gap基因標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.432x+37.099（R2=0.999），SacB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.408 7x+36.635 0（R2=0.999）。根據(jù)兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率求出gap和SacB基因擴(kuò)增效率分別為95.6%和96.5%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.1 Amplification curves (a,b) and melting curves (c,d) of standard plasmids

圖2 gap（a）和SacB（b）基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of gap (a) and SacB (b) gene

2.2 重組畢赤酵母中SacB基因拷貝數(shù)檢測

6個菌株基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果見表2。由表2可知，只有1號菌株在基因組中存在多個拷貝，其余5個重組菌株中SacB基因拷貝數(shù)均＜2，且RT-qPCR得到的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.27以下，檢測結(jié)果重復(fù)性良好。待測基因組DNA樣品的擴(kuò)增曲線及熔解曲線見圖3。由圖3可知，擴(kuò)增曲線呈光滑S型，熔解曲線呈單峰型，樣品均不存在非特異性擴(kuò)增。

圖3 待測基因組DNA樣品的擴(kuò)增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.3 Amplification curves (a,b) and melting curves (c,d) of genomic DNA samples to be tested

表2 實(shí)時熒光定量PCR檢測gap和SacB基因的拷貝數(shù)Table 2 Copy numbers of gap and SacB gene detected by real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 重組畢赤酵母基因拷貝數(shù)與總酶活的關(guān)系

不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母菌株于BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)96 h后測定總酶活，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在重組畢赤酵母菌株中，基因拷貝數(shù)低的菌株具有較低酶活，基因拷貝數(shù)高的菌株則具有較高酶活。整體趨勢上隨著拷貝數(shù)的增加，酶活亦增加，二者呈正相關(guān)關(guān)系。然而并不都是基因拷貝數(shù)越高菌株的蛋白表達(dá)量越多，在某些情況下，較高的基因拷貝菌株會導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量減少。如ZHU T等[16]通過研究不同豬胰島素前體（porcine insulin precursor，PIP）拷貝數(shù)的重組畢赤酵母時發(fā)現(xiàn)12個左右拷貝的重組菌分泌表達(dá)的蛋白最好，當(dāng)PIP基因拷貝數(shù)多于12時，重組蛋白的表達(dá)量受到顯著影響。高拷貝菌株表達(dá)量降低可能的原因是由于分泌表達(dá)通路受到阻礙，外源基因mRNA量過多加大了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊和胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)膲毫?。因此，通過比較不同拷貝數(shù)重組菌株的外源蛋白表達(dá)量才能篩選出最佳拷貝數(shù)的菌株[24]，從而獲得更多的重組蛋白。

圖4 基因拷貝數(shù)對重組畢赤酵母總酶活的影響Fig.4 Effects of gene copy numbers on total enzyme activities of recombinant Pichia pastoris

2.4 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)錄水平分析

本研究應(yīng)用兩步法RT-qPCR來定量基因表達(dá)，兩步法RT-qPCR的數(shù)據(jù)是可重現(xiàn)的，且其在靈敏度、靈活性和條件優(yōu)化等方面較一步法好[25]。在使用DNA結(jié)合染料時，采用兩步法操作方案可以通過控制解鏈溫度更輕松地消除引物二聚體[26]。

檢測重組畢赤酵母轉(zhuǎn)錄水平時選取5號菌株為單拷貝菌株，1號菌株為多拷貝菌株。通過RT-qPCR檢測不同誘導(dǎo)時間單拷貝與多拷貝菌株的cDNA樣品，結(jié)果見圖5、圖6。由圖5（a）-（b）、圖6（a）-（b）可知，樣品的擴(kuò)增曲線均呈光滑S型。由圖5（c）-（d）、圖6（c）-（d）可知，樣品的熔解曲線中均為單峰可知擴(kuò)增產(chǎn)物是特異性的。通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果見表3、表4。由表3、表4可知，單拷貝菌株的最高轉(zhuǎn)錄水平是0.42，遠(yuǎn)低于高拷貝菌株的2.13，單拷貝和多拷貝菌株的總酶活隨誘導(dǎo)時間增加均呈上升趨勢。通過折線圖呈現(xiàn)表3、表4中的數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖7。結(jié)合t檢驗(yàn)分析由圖7（a）可知，多拷貝菌株的轉(zhuǎn)錄水平比單拷貝菌株顯著提高（P＜0.05）。在添加甲醇24 h后單拷貝菌株及多拷貝菌株的轉(zhuǎn)錄水平均為最大值，其后二者轉(zhuǎn)錄水平隨誘導(dǎo)時間下降。由圖7（b）可知，單拷貝菌株與多拷貝菌株的酶活在添加甲醇24 h后均隨誘導(dǎo)時間不斷上升，結(jié)合t檢驗(yàn)分析知多拷貝菌株的酶活較單拷貝菌株顯著提高（P＜0.05）。究其緣由，在誘導(dǎo)過程中，碳源為補(bǔ)加的甲醇來提供，因此誘導(dǎo)過程中碳源的波動和頻繁出現(xiàn)的匱乏會影響轉(zhuǎn)錄，降低外源蛋白的合成速率[27]。RNA轉(zhuǎn)錄水平隨著誘導(dǎo)時間遞減，由于分泌蛋白的累積效應(yīng)，酶活會不斷增加。

表3 甲醇補(bǔ)料發(fā)酵中單拷貝菌株轉(zhuǎn)錄水平與酶活的關(guān)系Table 3 Relationship between transcription level and enzyme activity of single-copy strain in methanol supplementary fermentation

表4 甲醇補(bǔ)料發(fā)酵中多拷貝菌株轉(zhuǎn)錄水平與酶活的關(guān)系Table 4 Relationship between transcription level and enzyme activity of multi-copy strain in methanol supplementary fermentation

圖5 重組畢赤酵母單拷貝菌株擴(kuò)增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.5 Amplification curves (a,b) and melting curves (c,d) of recombinant Pichia pastoris single-copy strains

圖6 重組畢赤酵母多拷貝菌株擴(kuò)增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.6 Amplification curves(a,b) and melting curves(c,d) of recombinant Pichia pastoris multi-copy strains

圖7 不同拷貝數(shù)菌株的轉(zhuǎn)錄水平（a）與表達(dá)酶活（b）Fig.7 Transcriptional level (a) and expression enzyme activity (b) of strains with different copies

增加mRNA轉(zhuǎn)錄水平最常見的策略是引入多個外源基因的拷貝，多拷貝菌株通常表現(xiàn)為高表達(dá)重組蛋白[14，28]。錢曉芬等[15]用畢赤酵母表達(dá)牛乳鐵蛋白功能片段時發(fā)現(xiàn)重組蛋白產(chǎn)量隨著BlfFf基因拷貝數(shù)的增加而增加，但并非線性遞增，拷貝數(shù)為3的菌株產(chǎn)量相比單拷貝的菌株提高了150%。此外，畢赤酵母分泌表達(dá)異源蛋白與其攜帶的信號肽有關(guān)，KANG H K等[29]構(gòu)建的攜帶α信號肽的腸膜明串珠菌中左聚糖蔗糖酶基因的重組畢赤酵母成功的進(jìn)入了畢赤酵母的分泌途徑，而攜帶腸膜明串珠菌左聚糖蔗糖酶自身信號肽的重組菌株卻未能成功分泌，其研究中左聚糖蔗糖酶最高產(chǎn)酶量為8.72 U/mL。此外有假設(shè)指出[30]，不同基因可能會消除一些物種的特異性，使蛋白更傾向于跨物種間的表達(dá)。本研究構(gòu)建的重組畢赤酵母分泌表達(dá)效果較好，達(dá)13.96 U/mL，后續(xù)可以通過密碼子優(yōu)化、糖基化修飾、引入分子伴侶等技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化菌種來提高表達(dá)量。

3 結(jié)論

通過檢測重組畢赤酵母不同SacB基因拷貝數(shù)及相應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，成功篩選出高效分泌表達(dá)左聚糖蔗糖酶的重組菌株。重組畢赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1～3個拷貝范圍內(nèi)，隨著拷貝數(shù)增加，重組菌的酶活也隨之增加，其中多拷貝菌株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平（2.13）為單拷貝菌株（0.42）的5.1倍，多拷貝菌株的酶活（13.96 U/mL）比單拷貝菌株（5.48 U/mL）提高1.5倍。本研究說明畢赤酵母是表達(dá)SacB的良好宿主，繼續(xù)提高拷貝數(shù)有進(jìn)一步提高表達(dá)水平的潛力，同時表明可通過篩選出最佳基因拷貝數(shù)的重組畢赤酵母及重組菌的進(jìn)一步優(yōu)化來提高外源蛋白的表達(dá)量，為構(gòu)建其他外源基因的高表達(dá)重組畢赤酵母菌株提供參考。