西洋參總皂苷通過調控TGF－β1/CTGF通路對壓力性尿失禁大鼠尿道損傷及排尿功能的改善作用研究

張凱敏，李留霞，袁新枝，張紅彬

（1.漯河市婦幼保健院，河南 漯河 462300；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014）

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）即腹壓突然增加（如咳嗽或打噴嚏），尿液在膀胱內壓驅使下從尿道流出，其特點為正常情況下膀胱無遺尿，腹壓突增時尿液自動溢出，又被稱為真性壓力性尿失禁或應力性尿失禁［1］。流行病學調查表明，SUI發(fā)病率逐年升高，成年女性發(fā)病率約為20%，其中年齡≥40歲女性居多，SUI 不僅嚴重影響女性生活質量，同時也導致其心理和生理負擔加重，目前，SUI 已上升為社會和公共衛(wèi)生問題［2］。SUI 的非手術療法（如盆底肌肉訓練、藥物治療、生物反饋治療、子宮托以及針灸療法等）已取得一定進展，但因其易復發(fā)、副作用大等特點造成臨床推廣困難，因此，仍需要更具前景的藥物進行治療。西洋參也稱西洋人參或花旗參，屬五加科植物，具有廣泛生物活性與藥理作用，其藥用部分主要為根和莖葉［3］。西洋參總皂苷是從西洋參莖葉中提取的一種有效活性成分，具有降血糖、抑制腦組織細胞凋亡等藥理作用。雖有研究發(fā)現人參皂苷Rb1 可修復產后尿道組織損傷［4］，但目前關于西洋參總皂苷對SUI 大鼠尿道損傷修復作用研究尚未見文獻報道。因此，本研究通過建立大鼠SUI 模型，初步探討西洋參總皂苷對SUI 大鼠尿道損傷與排尿功能影響及作用機制，為臨床應用研究提供佐證材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

70 只SPF 級雌性未育SD 健康大鼠，體質量180～220 g，8周齡，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，許可證號：SCXK（滬）2018－0006，適應性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)環(huán)境室溫（24±1）℃，空氣相對濕度（55±5）%，光照晝夜交替循環(huán)12 h。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器

純度98%的西洋參總皂苷（陜西昂煦生物科技有限公司）；鹽酸米多君（國藥集團川抗制藥有限公司，國藥準字H20060551）；兔抗鼠轉化生長因子－β1（transforming growth factor－beta1，TGF－β1）多抗、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）多抗、膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）多抗、膠原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）多抗、羊抗兔二抗－HRP（英國Abcam 公司）；電泳儀、垂直電泳槽（美國Satan Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組

隨機選取60 只大鼠戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，依據模擬產傷并聯合雙側卵巢切除法建立SUI 模型，經導管排空膀胱，于腹部正中切口（1.0～1.5 cm），剝離雙側卵巢，縫合切口，取8 Fr弗萊氏導尿管置于陰道處，經氣囊注射無菌生理鹽水（3.0 mL），致使其陰道充分擴張，4 h 后撤掉導尿管，陰道氣囊擴張2 周后，麻醉大鼠，剝離組織，將大鼠兩側卵巢無菌摘除后縫合，結束后開展噴嚏實驗，排空大鼠膀胱，并注射美蘭液，刺激其鼻孔出現噴嚏反射，當大鼠尿道口出現藍色液體，即造模成功［5－6］。將建模成功的56 只大鼠，隨機分為模型組、西洋參總皂苷低劑量組、西洋參總皂苷高劑量組和陽性藥物組，每組各14 只，余下10 只未經任何處理，設為對照組。

1.2.2 干預方法

建模成功24 h 后，參照文獻［3］用量，西洋參總皂苷低、高劑量組大鼠分別按照50、100 mg/kg 劑量灌胃西洋參總皂苷，陽性藥物組大鼠灌胃20 mg/kg 劑量鹽酸米多君，對照組與模型組大鼠給予等量生理鹽水，每日灌胃1次，共計6周。

1.3 觀測指標

1.3.1 尿動力學指標檢測

末次給藥干預后，排空大鼠膀胱，通過導尿管向大鼠膀胱內注射無菌生理鹽水（100 μL/min），當大鼠尿道口第一滴尿液出現時的膀胱容積即為膀胱最大容積（maximum bladder capacity，MBC），并記錄此刻大鼠膀胱壓力即漏尿點壓力（leak point pressure，LPP），結束后排空膀胱，以相同流速繼續(xù)注射生理鹽水（注射量為LPP 測定時MBC 的50%），在大鼠腹部用手指緩慢施壓，致使腹壓逐步升高直至尿道口觀察到有液體溢出，記錄此時膀胱壓即為腹壓漏尿點壓（abdominal leakage pressure point，ALPP），重復多次，取均值。

1.3.2 膀胱內壓測定

尿動力學指標檢測結束后，將一根三通管導管通過大鼠左側頸靜脈置于膀胱內（作為給藥途徑），縫合并固定，一導管口連接壓力檢測器監(jiān)測膀胱壓力，另一導管口持續(xù)注射無菌生理鹽水（灌注速度依據MBC 確定），誘導膀胱收縮排尿，收集尿液，觀察大鼠排尿量、殘余尿量以及排尿效率，反復多次，取均值。

1.3.3 尿道組織形態(tài)學觀察

膀胱內壓測定結束后，處死大鼠，無菌摘取尿道組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（4 μm），脫蠟（20 min），蘇木精染色（3～5 min），1%（V/V）H2O2浸泡（10～30 s），伊紅染色（20 min），二甲苯透化（10 min），中性樹脂封固，光學顯微鏡觀察。

1.3.4 尿道組織TGF－ β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA水平檢測

取尿道組織，勻漿，Trizol法提取總RNA，測定純度、濃度，逆轉錄得cDNA，實時熒光定量PCR反應。反應體系：1.2 μL Taq 聚合酶、0.8 μL 上下游引物、4 μL 模板cDNA、14 μL ddH2O。擴增條件：預變性（94 ℃，30 s）、變性（94 ℃，5 s）、退火（59 ℃，30 s），共40個循環(huán)，加熔解曲線，降溫（50 ℃，30 s）。其中GAPDH為內參對照，數據分析采用2-△△Ct法，重復多次，取Ct均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 尿道組織TGF－ β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平檢測

取尿道組織，加RIPA 裂解緩沖液，離心取上清（5 000 r/min，15 min，離心半徑20 cm），采用蛋白BCA 試劑盒測定總蛋白濃度，將待測樣品通過電泳分離（100 V，80 min），轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液封閉2 h，樣品和TGF－β1（1：500）、CTGF（1∶500）、Collagen Ⅰ（1∶1 000）、Collagen Ⅲ（1∶1 000）一抗共同過夜孵育（4 ℃），TBST緩沖液洗膜，添加二抗HRP標記IgG（1∶2 000）孵育（室溫，2 h），洗膜，曝光，顯影。Image J軟件檢測樣品與GAPDH條帶灰度值。目標蛋白相對表達水平計算，即目標條帶與GAPDH條帶灰度間比值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 27.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，組間比較進行LSD－t檢驗，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 尿動力學指標水平比較

尿動力學指標MBC、LPP、ALPP水平經組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，模型組MBC、LPP、ALPP 均水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，西洋參總皂苷低、高劑量組與陽性藥物組MBC、LPP、ALPP水平均升高（P＜0.05）；與西洋參總皂苷低劑量組比較，西洋參總皂苷高劑量組與陽性藥物組MBC、LPP、ALPP 水平均升高，且陽性藥物組高于西洋參總皂苷高劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠尿動力學指標水平比較（±s）

表2 各組大鼠尿動力學指標水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與西洋參總皂苷低劑量組比較，cP ＜0.05；與西洋參總皂苷高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別對照組模型組西洋參總皂苷低劑量組西洋參總皂苷高劑量組陽性藥物組F值P值n 10 14 14 14 14 MBC（mL）6.43±0.80 1.45±0.60a 2.67±0.65ab 3.78±0.70abc 4.92±0.75abcd 93.298＜0.001 LPP（mm Hg）39.90±6.12 10.65±4.28a 19.78±4.86ab 25.89±5.52abc 32.94±5.35abcd 58.932＜0.001 ALPP（mm Hg）40.62±6.45 12.03±4.21a 20.24±4.92ab 27.35±5.06abc 34.56±5.37abcd 59.832＜0.001

2.2 膀胱內壓相關指標水平比較

膀胱內壓相關指標排尿量、殘余尿量排尿效率經組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，模型組排尿量、殘余尿量升高，排尿效率降低（P＜0.05）；與模型組比較，西洋參總皂苷低、高劑量組與陽性藥物組排尿效率升高，排尿量、殘余尿量降低（P＜0.05）；與西洋參總皂苷低劑量組比較，西洋參總皂苷高劑量組與陽性藥物組排尿效率升高，排尿量、殘余尿量降低（P＜0.05）；與西洋參總皂苷高劑量組比較，陽性藥物組排尿效率升高，排尿量、殘余尿量降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠膀胱內壓相關指標水平比較（±s）

表3 各組大鼠膀胱內壓相關指標水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與西洋參總皂苷低劑量組比較，cP ＜0.05；與西洋參總皂苷高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別對照組模型組西洋參總皂苷低劑量組西洋參總皂苷高劑量組陽性藥物組F值P值n 10 14 14 14 14排尿量（mL/d）56.30±12.06 130.86±15.10a 102.59±14.11ab 85.72±13.62abc 70.56±13.04abcd 56.310＜0.001殘余尿量（mL/d）0.62±0.31 3.89±0.90a 2.95±0.84ab 2.07±0.76abc 1.24±0.60abcd 39.953＜0.001排尿效率（%）90.35±13.01 30.14±12.79a 48.35±13.04ab 62.71±13.16abc 76.95±13.23abcd 40.639＜0.001

2.3 尿道組織病理學變化比較

對照組大鼠尿道組織括約肌細胞結構清晰、完整，無異常病理變化；模型組組織細胞、細胞核數量減少、萎縮且結構紊亂，肌層厚度變薄、各肌束間隙擴大，染色不均勻，細胞出現空泡現象；西洋參總皂苷各劑量組與陽性藥物組病理狀況改善顯著，結構相對清晰、細胞核數量相對增加，肌層厚度增加且各肌束細胞間隙縮小，細胞內幾乎觀察不到空泡現象。見圖1。

圖1 尿道組織括約肌病理學變化（HE，×200）

2.4 尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA水平比較

尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA 水平經組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，模型組TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，西洋參總皂苷低、高劑量組與陽性藥物組TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA 水平升高（P＜0.05）；與西洋參總皂苷低劑量組比較，西洋參總皂苷高劑量組與陽性藥物組TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA 水平升高，且陽性藥物組高于西洋參總皂苷高劑量組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA水平比較（±s）

表4 各組大鼠尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與西洋參總皂苷低劑量組比較，cP ＜0.05；與西洋參總皂苷高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別對照組模型組西洋參總皂苷低劑量組西洋參總皂苷高劑量組陽性藥物組F值P值n5 5 5 5 5 TGF－β1 0.98±0.06 0.45±0.02a 0.60±0.03ab 0.73±0.04abc 0.85±0.05abcd 119.361＜0.001 CTGF 0.92±0.05 0.37±0.03a 0.53±0.02ab 0.67±0.03abc 0.80±0.04abcd 186.786＜0.001 Collagen Ⅰ0.86±0.04 0.31±0.05a 0.45±0.04ab 0.60±0.03abc 0.72±0.04abcd 143.201＜0.001 Collagen Ⅲ0.82±0.05 0.25±0.02a 0.38±0.05ab 0.52±0.03abc 0.65±0.04abcd 157.690＜0.001

2.5 尿道組織TGF－ β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平比較

尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平經組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，模型組TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，西洋參總皂苷低、高劑量組與陽性藥物組TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平升高（P＜0.05）；與西洋參總皂苷低劑量組比較，西洋參總皂苷高劑量組與陽性藥物組TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平升高，且陽性藥物組高于西洋參總皂苷高劑量組（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達

表5 各組大鼠尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平比較（±s）

表5 各組大鼠尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與西洋參總皂苷低劑量組比較，cP ＜0.05；與西洋參總皂苷高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別對照組模型組西洋參總皂苷低劑量組西洋參總皂苷高劑量組陽性藥物組F值P值n5 5 5 5 5 TGF－β1 0.89±0.05 0.35±0.06a 0.49±0.03ab 0.62±0.04abc 0.75±0.05abcd 101.126＜0.001 CTGF 0.83±0.06 0.28±0.05a 0.42±0.02ab 0.55±0.03abc 0.68±0.04abcd 128.528＜0.001 Collagen Ⅰ0.76±0.06 0.22±0.05a 0.36±0.03ab 0.49±0.05abc 0.61±0.04abcd 99.707＜0.001 Collagen Ⅲ0.80±0.07 0.20±0.05a 0.30±0.02ab 0.40±0.03abc 0.56±0.04abcd 134.757＜0.001

3 討論

SUI 被認為是尿道對控尿因“開關－閥門”失控引起的功能性障礙疾病。由于SUI 病理復雜，具體作用機制至今尚未闡明，依據現有研究認為其主要由妊娠、陰道分娩以及絕經后雌性激素水平下降等因素，造成盆底組織松弛、陰道結締組織支撐減少、尿道內括約肌功能障礙所致［7］。SUI 臨床典型癥狀即腹壓增加出現不自主漏尿等現象（包括尿頻尿急、急迫性尿失禁、排尿后膀胱區(qū)脹滿感等）［8］。

作為泌尿系統(tǒng)基本結構與功能單位，尿道括約肌細胞結構和功能異常與SUI發(fā)展息息相關。尿道括約肌細胞凋亡、肌小節(jié)結構與功能異常，使得具有收縮功能的肌細胞數量減少、單位肌纖維收縮能力減弱，從而導致尿道括約肌功能以及控尿能力下降［9－10］。本研究結果顯示，與模型組比較，西洋參總皂苷低、高劑量組和陽性藥物組MBC、LPP、ALPP、排尿效率升高，排尿量、殘余尿量降低；HE 結果顯示，與模型組比較，西洋參總皂苷各劑量組、陽性藥物組大鼠尿道組織病理變化均得以有效改善，說明西洋參總皂苷能有效改善大鼠膀胱相關排尿功能，減輕尿道組織損傷。

成纖維細胞在盆底纖維結締組織中含量豐富，它可通過分泌多類細胞外基質（extracellular matrix，ECM），進而起到調節(jié)膠原作用，其中TGF－β1、CTGF因子能促進成纖維細胞分泌和收縮［11］。TGF－β1、CTGF在SUI患者纖維結締結構組織中含量可能發(fā)生變化，推測其可能與SUI發(fā)生發(fā)展密不可分。TGF－β1是一類多功能蛋白多肽，具有促進成纖維細胞生長、調節(jié)ECM合成等作用，且可直接參與組織損傷修復［12］。TGF－β1既與膠原、彈性蛋白合成、降解直接相關，又介導ECM降解酶和相關抑制因子活性表達，且在分娩或手術等造成盆底結締組織損傷修復過程中起關鍵作用，TGF－β1不僅和多種細胞因子相關，還可上調膠原mRNA和蛋白表達［13］。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌蛋白，經TGF－β激活后由成纖維細胞合成和分泌，是成纖維細胞增殖的下游介質［14－15］。TGF－β1因子可作為傷口愈合、組織修復和過度ECM積累的驅動因素，它依賴CTGF相關生物功能（如促進細胞增殖、ECM合成等）發(fā)揮作用，此外，CTGF作為下游重要調節(jié)劑，也是各組織中TGF－β1下游效應分子［16］。研究發(fā)現，CTGF可促進TGF－β1信號傳導，進而介導ECM相關蛋白（如膠原蛋白）表達［17］。本研究結果顯示，西洋參總皂苷各劑量組尿道組織TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA和蛋白水平升高，提示西洋參總皂苷可通過調控TGF－β1、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ分子表達，降低SUI大鼠尿道損傷及相關功能障礙。

綜上所述，西洋參總皂苷可能通過介導TGF－β1/CTGF 通路相關分子表達，減輕SUI 大鼠尿道損傷，改善排尿功能障礙，這一結果可為西洋參總皂苷相關藥物研發(fā)與應用提供新思路。