G蛋白偶聯(lián)雌激素受體激活對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征的影響

楊 翠， 叢竹凱， 趙 峰， 沈子淵， 朱 曦

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是ICU內(nèi)常見(jiàn)的危重病，是指各種因素引起的急性彌漫性肺水腫，病死率約為40%[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，ARDS發(fā)生率和嚴(yán)重程度與性別相關(guān)。相較于女性，男性更易發(fā)生ARDS且病死率更高，因此有學(xué)者將男性列為發(fā)生ARDS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。性激素是這一性別偏移的重要原因之一。不同于雄激素的抑制性效應(yīng)，體內(nèi)雌激素具有免疫保護(hù)作用[3]。但是雌激素減輕肺損傷的機(jī)制有待闡明。此前有研究探索了經(jīng)典雌激素受體-α(estrogen receptor-alpha, ER-α)參與介導(dǎo)了雌激素的肺保護(hù)作用[4]，但是非經(jīng)典雌激素受體G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor，GPER)對(duì)ARDS的影響有待明確。因此本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)氣管內(nèi)滴法模擬ARDS，從動(dòng)物探索激活GPER對(duì)ARDS的影響，為ARDS的性別差異以及雌激素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用SPF級(jí)6～8周BALB/c系小鼠(20～25 g)均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，購(gòu)買后在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，溫度21～25 ℃，濕度約50%，保證充足的水源和食物。所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》進(jìn)行。

1.1.2 試劑 LPS(大腸桿菌血清型 O111:B4)和戊巴比妥鈉均購(gòu)自Sigma Aldrich(美國(guó))；GPER特異性激動(dòng)劑(G1)和玉米油購(gòu)自MedChemExpress(美國(guó))；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購(gòu)自R&D Systems(美國(guó))；雌激素和白蛋白ELISA試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司(中國(guó))；瑞氏-吉姆撒染色試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司(中國(guó))；兔抗小鼠GPER抗體購(gòu)于CST(美國(guó))；小鼠抗小鼠β-actin、抗體山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均購(gòu)于普利萊基因技術(shù)有限公司(中國(guó))。

1.2方法

1.2.1 小鼠雙側(cè)卵巢去勢(shì)模型 雌性小鼠雙側(cè)卵巢去勢(shì)模型參照文獻(xiàn)[5]方法。在ARDS造模前兩周，雌性小鼠隨機(jī)分為雙側(cè)卵巢切除(ovariectomy, OVX)組和假手術(shù)雌性(Sham)組。為確認(rèn)卵巢切除手術(shù)的成功，小鼠處死后收集子宮并稱重計(jì)算子宮比(子宮重量/體質(zhì)量)，ELISA法檢測(cè)血清雌激素水平。

1.2.2 小鼠ARDS模型 小鼠ARDS模型參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道。小鼠稱重后編號(hào)，腹腔注射G1(5 mg/kg)或等體積玉米油，30 min后對(duì)側(cè)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)麻醉。待麻醉進(jìn)入手術(shù)期后，沿頸部腹側(cè)中線處切開(kāi)以暴露氣管，22號(hào)微型注射器刺穿環(huán)甲膜，注入LPS(2 mg/kg)或等體積PBS，滴注后將小鼠垂直放置1 min，以確保液體肺內(nèi)均勻分布。LPS滴注后24 h，小鼠麻醉并采集心尖血處死，收集肺組織和BALF。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)包括雄性組、OVX組和Sham組，每組再隨機(jī)分為四小組，即PBS組(空白對(duì)照組，小鼠腹腔注射玉米油100 μL、氣管內(nèi)滴注PBS 40 μL)、LPS組(即ARDS組，小鼠腹腔注射玉米油100 μL、氣管內(nèi)滴注LPS，2 mg/kg，體積40 μL)、LPS+G1組(小鼠腹腔注射G1 5 mg/kg，體積100 μL，30 min后氣管內(nèi)滴注LPS，2 mg/kg，體積40 μL)和G1組(小鼠腹腔注射G1 5 mg/kg，體積100 μL，30 min后氣管內(nèi)滴注PBS 40 μL)，每小組12只，6只HE染色，6只用于收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。

1.2.4 BALF收集與細(xì)胞計(jì)數(shù) 1 mL預(yù)冷生理鹽水用20 G規(guī)格的靜脈留置針注入肺組織反復(fù)抽吸3次，收集的BALF離心(1000 r/min，5 min，4 ℃)收集上清，分裝后存于-80 °C以測(cè)定細(xì)胞因子和白蛋白。沉積的細(xì)胞沉淀重懸后，celldrop細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)3次后取均值，獲得細(xì)胞總數(shù)；參照試劑盒說(shuō)明書(shū)吉姆薩染色后，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算中性粒細(xì)胞占比，該比例乘以BALF中的細(xì)胞總數(shù)，即得BALF中性粒細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5 HE染色 肺組織4%多聚甲醛室溫48 h固定，石蠟包埋，切成5 mm厚的切片。按說(shuō)明書(shū)用蘇木精-伊紅染色，經(jīng)漂洗、脫水和透明后，中性樹(shù)膠封片。數(shù)字病理顯微鏡下觀察并掃描(每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野)，根據(jù)美國(guó)胸科學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[7]計(jì)算肺損傷評(píng)分。

1.2.6 BALF中細(xì)胞因子、白蛋白、雌激素和總蛋白濃度的測(cè)定 根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-6、白蛋白和雌激素的濃度，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1OVX組雌激素和子宮指數(shù)變化 與Sham組相比，OVX組雌激素水平(P<0.001)和子宮指數(shù)(P<0.0001)明顯降低。見(jiàn)圖1。

注：OVX為雙側(cè)卵巢切除組；Sham為假手術(shù)雌性組；***P<0.001；****P<0.0001

2.2G1對(duì)雌雄小鼠肺組織病理?yè)p傷的影響 滴注LPS后小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞，肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)充盈富含蛋白的液體，伴肺泡間隔增厚和肺泡限閉。G1預(yù)處理可減輕LPS誘導(dǎo)的雄性組(P<0.0001)和OVX組小鼠(P=0.0001)肺泡病理?yè)p傷，降低肺損傷評(píng)分，但對(duì)Sham組無(wú)影響(P=0.9983)。見(jiàn)圖2。

注：LPS為脂多糖；G1為GPER特異性激動(dòng)劑；OVX為雙側(cè)卵巢切除組；Sham為假手術(shù)雌性組；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

2.3G1對(duì)雌雄小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 LPS刺激后小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且增大多為中性粒細(xì)胞；OVX組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量多于假手術(shù)組。與單純LPS組相比，G1處理可減輕雄性和OVX組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)目(均P<0.0001)，但對(duì)Sham組無(wú)影響(P=0.9993)。見(jiàn)圖3。

注：黑箭頭為肺泡巨噬細(xì)胞；紅箭頭為中性粒細(xì)胞；LPS為脂多糖；G1為GPER特異性激動(dòng)劑；OVX為雙側(cè)卵巢切除組；Sham為假手術(shù)雌性組；BALF為肺泡灌洗液；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

2.4G1對(duì)雌雄小鼠BALF中TNF-α和IL-6的影響 與PBS組相比，LPS組雌雄小鼠BALF中TNF-α(均P<0.0001)和IL-6(雄性和OVX組均P<0.0001，假手術(shù)組P=0.0012)均明顯升高，且OVX組TNF-α(P=0.0264)和IL-6(P=0.0015)高于假手術(shù)組。G1處理可減輕雄性和OVX雌性小鼠BALF中TNF-α(雄性：P<0.0001，OVX：P<0.01)和IL-6(雄性：P<0.001，OVX：P<0.01)，但對(duì)Sham組無(wú)影響(均P>0.9999)。見(jiàn)圖4。

注：LPS為脂多糖；G1為GPER特異性激動(dòng)劑；OVX為雙側(cè)卵巢切除組；Sham為假手術(shù)雌性組；BALF為肺泡灌洗液；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；IL-6為白細(xì)胞介素-6；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

2.5G1對(duì)雌雄小鼠BALF中總蛋白和白蛋白的影響 LPS刺激可以引起雄性和雌性小鼠BALF中總蛋白含量的升高(均P<0.001)，且OVX組小鼠BALF中總蛋白含量高于Sham組小鼠(P=0.0403)。給予G1可以抑制LPS引起的雄性(P<0.0001)和OVX雌性(P=0.0151)小鼠BALF總蛋白的升高，但對(duì)Sham組小鼠則無(wú)影響。LPS可以引起雄性和OVX小鼠BALF中白蛋白含量的升高(均P<0.0001)，Sham組小鼠BALF白蛋白雖有升高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0832)，OVX組白蛋白含量也有高于Sham組小鼠的趨勢(shì)(P=0.2817)。給予G1可以抑制LPS引起的雄性小鼠BALF白蛋白的升高(P<0.0001)，也有抑制OVX組白蛋白升高的趨勢(shì)(P=0.0548)，但對(duì)Sham組小鼠則無(wú)影響(P>0.9999)。見(jiàn)圖5。

注：BALF為肺泡灌洗液；LPS為脂多糖；G1為GPER特異性激動(dòng)劑；OVX為雙側(cè)卵巢切除組；Sham為假手術(shù)雌性組；****P<0.0001

3 討論

本研究中通過(guò)氣管內(nèi)滴注LPS方法成功建立了小鼠ARDS模型，在此基礎(chǔ)上探究激活GPER對(duì)雌雄小鼠肺部急性炎癥反應(yīng)的影響。研究結(jié)果表明，GPER特異性激動(dòng)劑G1預(yù)處理可顯著改善LPS誘導(dǎo)的雄性和OVX小鼠肺病理?yè)p傷和肺泡-毛細(xì)血管屏障破壞，抑制肺部中性粒細(xì)胞的募集以及BALF中促炎因子TNF-α和IL-6水平的升高；假手術(shù)雌性小鼠激活GPER卻無(wú)類似的肺保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為雌激素的肺保護(hù)作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，盡管不能完全模擬臨床情況，但為研究ARDS的性別偏移提供一個(gè)方向。

目前認(rèn)為，過(guò)度激活的炎癥是ARDS的病理特征[8]，雌激素具有調(diào)節(jié)肺部炎癥的作用。Card等[9]之前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)滴注LPS后，雄性和OVX雌性小鼠BALF中炎癥介質(zhì)(IL-1β和IL-6)水平明顯高于假手術(shù)小鼠，使用雌激素(17β-雌二醇)處理后OVX小鼠炎癥介質(zhì)降至正常雌性小鼠水平，提示17β-雌二醇可減輕OVX小鼠肺部炎癥。本研究中雄性和OVX雌性小鼠肺部炎癥細(xì)胞數(shù)目和BALF中IL-6和TNF-α均高于假手術(shù)小鼠，也間接證明了雌激素減輕肺損傷的作用。Vegeto等[4]也證實(shí)，雌激素可抑制雌雄小鼠的肺內(nèi)促炎介質(zhì)的分泌，此外ER-α或ER-β基因敲除小鼠的應(yīng)用揭示了ER-α而非ER-β在介導(dǎo)雌激素抗炎作用中的關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，激活GPER可抑制LPS誘導(dǎo)的雄性和OVX小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并降低BALF中IL-6和TNF-α水平。然而，在正常的雌性小鼠中未檢測(cè)到類似的抗炎作用。一項(xiàng)創(chuàng)傷性腦損傷的研究[10]同樣證明了G1的這一性別特異性，G1處理顯著抑制了雄性和OVX雌性小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后體內(nèi)炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，但在假手術(shù)雌性小鼠體內(nèi)卻誘導(dǎo)促炎介質(zhì)的生成。以上結(jié)果提示，G1可以發(fā)揮類似雌激素的抑制肺部炎癥的作用，但G1的抑炎作用也受體內(nèi)雌激素水平的影響，G1僅在雌激素水平較低的情況下才顯現(xiàn)出抑炎效果。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)G1可減輕LPS誘導(dǎo)的肺泡毛細(xì)血管屏障損傷。

正常情況下，由于肺泡毛細(xì)血管屏障通透性較低，血液中的蛋白無(wú)法透過(guò)此屏障進(jìn)入肺泡中，故BALF中蛋白含量較低，其中大分子蛋白(例如白蛋白)含量更低；在ARDS病理狀態(tài)下，肺泡毛細(xì)血管屏障受損，通透性增高，血液中的蛋白透過(guò)肺泡屏障進(jìn)入肺泡，導(dǎo)致BALF中蛋白含量升高[11]。研究[9]表明，ARDS小鼠肺泡毛細(xì)血管屏障的受損也存在性別差異。LPS刺激后雄性和OVX雌性小鼠BALF中的白蛋白含量升高程度高于正常雌性小鼠，本研究結(jié)果與之一致。而給予OVX小鼠雌激素則可逆轉(zhuǎn)漏入肺泡內(nèi)的白蛋白至完整雌性小鼠水平[9]，提示雌激素可以改善體內(nèi)雌激素水平較低的雌性小鼠肺泡毛細(xì)血管屏障。雌激素干預(yù)對(duì)雄性動(dòng)物肺泡毛細(xì)血管屏障也有保護(hù)作用。Hamidi等[12]研究表明，將雌激素注入肺循環(huán)可顯著減輕百草枯和谷氨酸激動(dòng)劑N-甲基-d-天冬氨酸引起的雄性大鼠肺部白蛋白滲漏。幾乎沒(méi)有研究探索何種受體介導(dǎo)了雌激素改善肺泡毛細(xì)血管屏障的作用，本研究發(fā)現(xiàn)GPER激動(dòng)劑G1可減輕LPS誘導(dǎo)的肺泡毛細(xì)血管屏障損傷，并且G1提前干預(yù)只能減輕雄性和OVX雌性小鼠BALF中總蛋白的升高，但對(duì)完整雌性小鼠則無(wú)影響。另外，G1干預(yù)也可以抑制LPS引起的雄性小鼠BALF中白蛋白含量的升高，也具有減輕OVX雌性小鼠白蛋白含量的趨勢(shì)，推測(cè)之所以在OVX組內(nèi)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)閿?shù)據(jù)量過(guò)少以及組內(nèi)數(shù)據(jù)過(guò)于分散，若加大數(shù)據(jù)量則可能差異會(huì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，GPER激動(dòng)劑干預(yù)可減輕雄性和OVX雌性小鼠ARDS的嚴(yán)重程度，但對(duì)假手術(shù)雌性小鼠ARDS無(wú)改善作用。這提示激活GPER可以發(fā)揮類似雌激素的肺保護(hù)作用，并且這一保護(hù)作用受體內(nèi)雌激素水平影響，僅在雌激素水平較低時(shí)GPER激活具有肺保護(hù)作用，但激活GPER減輕ARDS的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。