microRNA調(diào)控膿毒癥中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的研究進展

陳聰敏, 丁新耘， 馬 源， 張曉慧, 馬玉清

中性粒細(xì)胞是重要的固有免疫細(xì)胞，機體發(fā)生感染時最先到達炎癥部位，釋放大量炎癥因子并吞噬病原體。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)是指活化的中性粒細(xì)胞向胞外排出經(jīng)抗菌蛋白修飾的染色質(zhì)[1]。膿毒癥時持續(xù)大量的炎癥介質(zhì)觸發(fā)NETs不受控制釋放、捕獲和殺死病原體的同時，導(dǎo)致組織器官損害(如低血壓、低氧血癥、凝血障礙、腎臟、肝臟和神經(jīng)功能障礙[2])。NETs的產(chǎn)生途徑已逐漸清晰，但NETs的調(diào)控機制目前尚不明確。

microRNA(miRNA)是普遍存在于真核細(xì)胞中的非編碼RNA，參與細(xì)胞的生理過程和疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括膿毒癥時NETs的產(chǎn)生。近年來有研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，miR-3146誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生，可以加重痛風(fēng)發(fā)作；miR-144激活NETs，加重輸血相關(guān)急性肺損傷；miR-146a、miR-155、miR-378a-3p和miR-15b-5p可調(diào)節(jié)NETs的形成以及膿毒癥相關(guān)器官損傷。因此，需要明確miRNA調(diào)控膿毒癥NETs介導(dǎo)臟器損傷的具體機制，以期為膿毒癥靶向治療提供有效策略。

1 miRNA 的生物合成與功能

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA分子，長度約為18～24個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后基因表達中發(fā)揮作用。miRNA的生物合成始于RNA聚合酶Ⅱ的基因轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNA前體(pri-miRNA)被Drosha-DGCR8復(fù)合物剪切成具有發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的pre-miRNA[6]。通過Exportin-5蛋白出核后，pre-miRNA被Dicer酶切割成雙鏈miRNA。成熟的miRNA功能鏈與AGO2蛋白一起組裝到miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中[6]。RISC中的miRNA與其靶信使核糖核酸(mRNA)的3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)堿基配對，抑制其翻譯或者降解mRNA；然而在某些條件下(如細(xì)胞應(yīng)激、血清饑餓)，miRNA促進mRNA的表達[7]。miRNA調(diào)控人類30%左右的基因表達，參與細(xì)胞的分化、生長、增殖、黏附、遷移和凋亡等生理過程，同時參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展[8-10]。

2 NETs的發(fā)現(xiàn)

2004年Brinkmann等[1]發(fā)現(xiàn)在佛波酯的刺激下，活化的炎性中性粒細(xì)胞向胞外釋放由組蛋白、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)等抗菌蛋白修飾的脫氧核糖核酸(DNA)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即NETs。

中性粒細(xì)胞形成NETs的過程被稱為NETosis，主要包括三種途徑：①自殺式NETosis[11]。此經(jīng)典途徑大約需要2～3 h，通過中性粒細(xì)胞的死亡形成。被佛波酯、病原體、炎癥因子等刺激后，中性粒細(xì)胞通過蛋白激酶C(PKC)/纖維肉瘤蛋白(Raf)/絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen specie，ROS)，激活自噬。核酶肽酰精氨酸脫亞氨酶4(peptidylarginine dei-minase4，PAD4)將組蛋白H3修飾為瓜氨酸化組蛋白H3(CitH3),導(dǎo)致染色質(zhì)解聚；同時MPO和NE移位核內(nèi)，協(xié)同染色質(zhì)解聚，核膜破裂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進入胞質(zhì)，網(wǎng)羅抗菌蛋白，最后被釋放到胞外，消滅病原體[12]。②存活式NETosis[13]。不依賴ROS的途徑且僅需要數(shù)分鐘。由Toll樣受體和補體C3介導(dǎo)NETs的產(chǎn)生，并以囊泡釋放胞外，此時無核的中性粒細(xì)胞仍具備吞噬功能，與自殺式NETosis相比，此途徑的NETs對核酸酶更耐受，且能有效根除病原體。③來源于線粒體DNA的存活式NETosis，也依賴ROS的產(chǎn)生[14]。

3 膿毒癥中NETs的兩面性

膿毒癥時中性粒細(xì)胞釋放的NETs是一把雙刃劍，消滅病原體的同時也遭受NETs相關(guān)組織損傷和器官衰竭。有研究[15]表明，NETs及其組分與膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，推薦其作為膿毒癥診治的新型生物標(biāo)志物。

3.1膿毒癥中NETs的防御功能 膿毒癥指因宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[16]。目前全球膿毒癥患者已達4900萬人，其死亡人數(shù)占全世界死亡人口的20%。感染早期NETs的產(chǎn)生對消除病原微生物至關(guān)重要。DNA是NETs發(fā)揮抗菌活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Clark等[17]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脂多糖(LPS)刺激的血小板和中性粒細(xì)胞共同培養(yǎng)后，NETs大量生成，并具有捕獲大腸桿菌的能力，使用DNA酶降解后，細(xì)菌捕獲能力明顯減弱。膿毒癥時入侵的病原微生物被固定于網(wǎng)狀纖維骨架中防止擴散，DNA酶破壞其結(jié)構(gòu)完整性后，細(xì)菌從NETs中釋放，加重疾病進展。組蛋白是NETs中含量最豐富、殺菌活性最強的成分，病原體被DNA纖維骨架物理遏制后，局部高濃度組蛋白開始發(fā)揮殺菌作用。研究[1]發(fā)現(xiàn)，組蛋白可在30 min內(nèi)殺死福氏鏈球菌、鼠傷寒鏈球菌和金黃色葡萄球菌，使用組蛋白抗體后，可消除NETs的殺菌作用。富含精氨酸的組蛋白H4在細(xì)胞膜表面形成泡狀結(jié)構(gòu)和孔隙，破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)；富含賴氨酸的組蛋白H2B通過脂磷壁酸與金黃色葡萄球菌結(jié)合，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，二者可通過不同機制清除病原微生物[18]。NETs的組分NE也具有抗菌活性，其通過降解大腸桿菌細(xì)胞壁的外膜蛋白A，破壞細(xì)菌完整性。在膿毒癥模型中，NE基因缺陷型小鼠較野生型小鼠清除大腸桿菌的能力降低，病死率升高[19]?？咕鞍譓PO可將過氧化氫和氯化物轉(zhuǎn)化為次氯酸，滲透入菌體內(nèi)，與細(xì)菌蛋白、酶等發(fā)生氧化反應(yīng)，干擾糖代謝，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。MPO 缺乏癥患者對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌等病原微生物的殺傷力減弱，細(xì)菌感染明顯增加，誘發(fā)或加重炎癥性疾病[20]。

3.2膿毒癥中NETs的損傷作用 NETs抗菌的同時也介導(dǎo)組織器官的損傷。膿毒癥時異常數(shù)量的NETs不能被DNA酶充分降解，導(dǎo)致毛細(xì)血管阻塞、微循環(huán)受損、炎癥反應(yīng)加強以及組織器官損傷。如游離DNA(cell free DNA，cfDNA)不僅損傷纖溶過程，而且通過與紅細(xì)胞、血小板、纖維蛋白和凝血因子的結(jié)合，強化血栓超微結(jié)構(gòu)[21]；NETs以劑量依賴的方式介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞死亡，使用組蛋白抗體可以降低NETs介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，表明產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要成分是組蛋白[22]。Denning等[23]認(rèn)為，NETs及其組分cfDNA、組蛋白、MPO屬于損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)，可進一步激活免疫細(xì)胞，擴大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)器官功能損傷。

4 miRNA對膿毒癥時NETosis的調(diào)節(jié)

大多數(shù)免疫細(xì)胞的研究都涉及miRNA在巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的信息依然有限。NETosis機制目前尚未完全闡明，但有三個關(guān)鍵步驟，即ROS產(chǎn)生、PAD4介導(dǎo)的染色質(zhì)解聚、自噬激活；miRNA為膿毒癥時NETosis的有效調(diào)控因子，主要靶向通過以下三個過程發(fā)揮作用。

4.1miR-146a通過ROS調(diào)控NETs

ROS是觸發(fā)NETosis的分子開關(guān)，能夠促進PAD4誘導(dǎo)的染色質(zhì)解聚，介導(dǎo)NE和MPO入核，激活自噬，維持自身高水平狀態(tài)等。在膿毒癥小鼠模型中，使用ROS有效清除劑丙酮酸乙酯，可減輕NETs介導(dǎo)的腸屏障功能障礙[24]。因此ROS對NETs的形成至關(guān)重要。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過ROS調(diào)控NETs的生成。Arroyo等[25]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清中miR-146a水平降低并伴有NETs增多。miR-146a基因缺陷的膿毒癥小鼠體內(nèi)ROS水平明顯升高，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放大量NETs，進一步引起肺泡上皮損傷和微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞損傷[26]。miR-146a調(diào)控ROS的具體機制與Toll樣受體4(TLR4)/內(nèi)向整流鉀通道(IRK1)/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路相關(guān)。miR-146a可直接靶向TLR4 mRNA、IRK1 mRNA和TRAF6 mRNA的3′-UTR，使其翻譯受阻，降低下游NF-κB活性，減少炎癥因子釋放[27-28]。有學(xué)者[26]證實，miR-146a基因缺陷的中性粒細(xì)胞表面TLR4高表達，NF-κB活性增強，產(chǎn)生更高水平的炎癥介質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)促炎因子水平與細(xì)胞衰老程度呈正相關(guān)，老化的中性粒細(xì)胞會過度產(chǎn)生ROS[29]。因此，當(dāng)miR-146a基因缺陷，使得TLR4/IRK1/TRAF6/NF-κB信號通路活性增加，中性粒細(xì)胞處于高炎癥水平，導(dǎo)致老化型中性粒細(xì)胞占比明顯增加，ROS大量產(chǎn)生，誘導(dǎo)NETosis。

4.2miR-155通過PAD4調(diào)控NETs

人體內(nèi)存在五種PAD4酶，其中核酶PAD4高度表達于中性粒細(xì)胞。NETs形成過程中PAD4以鈣依賴的方式催化組蛋白H3的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，導(dǎo)致染色質(zhì)正電荷丟失，組蛋白與DNA的結(jié)合力減弱，染色質(zhì)解聚，使用PAD4抑制劑BMS-P5可阻斷NETosis，并延緩疾病進展[30]。因此，PAD4酶在NETosis中極為重要。在LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克模型中，PAD4基因敲除小鼠的NETosis受到抑制，腸道炎癥水平減輕，腸屏障損傷得到明顯改善[31]；同時體外實驗發(fā)現(xiàn)，NETs以劑量依賴性的方式損傷結(jié)直腸癌細(xì)胞(Caco-2)上皮屏障。

Hawez等[32]發(fā)現(xiàn)，佛波酯刺激miR-155模擬物轉(zhuǎn)染的中性粒細(xì)胞，PAD4 mRNA表達上調(diào)，且DNA-組蛋白復(fù)合物含量增加；Avin等[33]在膿毒癥模型中驗證了這一觀點，miR-155基因敲除小鼠PDA4和NETs降低，中性粒細(xì)胞浸潤減少，膿毒癥肺損傷程度減輕。PAD4是miR-155的直接靶點，miR-155通過靶向PAD4 3′-UTR區(qū)域一段互補的AU序列，明顯提高PAD4 mRNA水平，減弱膿毒癥小鼠NETs相關(guān)的臟器損害[32]。真正評估m(xù)iR-155的作用還需臨床試驗，研究膿毒癥病理條件下rs767649對于NETosis的影響[34]。Chen等[35]提出，miR-3164靶向PAD4 mRNA的3′-UTR，下調(diào)PAD4 mRNA，PAD4翻譯抑制后，CitH3產(chǎn)生減少，在膿毒癥病理生理條件下，miR-3164是否靶向PAD4，仍需進一步研究。

4.3miR-15b-5p和miR-378a-3p通過自噬調(diào)節(jié)NETs

自噬是以雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體為標(biāo)志，融合溶酶體后降解細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分，實現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)利用，維持真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬維持高水平的ROS，導(dǎo)致NETs持續(xù)釋放，抑制自噬后染色質(zhì)解聚、細(xì)胞凋亡活動受阻[36]。膿毒癥患者體內(nèi)NETs生成增加伴隨自噬水平升高，死亡患者NETs生成減少且自噬受損[37]。由此可見，自噬與膿毒癥NETosis密切相關(guān)。

miRNA參與自噬相關(guān)蛋白和信號通路的調(diào)控。Jiao等[38]發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠血清中NETs濃度與富含miR-15b-5p和miR-378a-3p的外泌體呈正相關(guān)。將預(yù)處理的中性粒細(xì)胞與LPS刺激的血小板源性外泌體共同培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，3-甲基腺嘌呤抑制NETs形成，雷帕霉素進一步促進NETs形成。由此可見，miR-15b-5p和miR-378a-3p通過調(diào)控自噬，調(diào)控NETs生成。蛋白激酶B(Akt)/哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路是經(jīng)典的自噬負(fù)調(diào)節(jié)途徑，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)是一種Akt激活劑，通過Thr-308磷酸化激活A(yù)kt。研究[39]發(fā)現(xiàn)，PDK1的3′-UTR包含miR-378a-3p的一段互補序列；Li等[40]也證明，人類、小鼠和犬類的PDK1均包含miR-378a-3p的結(jié)合靶點。因此，PDK1是miR-378a-3p的直接靶點。在轉(zhuǎn)染miR-15b-5p和miR-378a-3p模擬物的HL-60細(xì)胞中，PDK1、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)水平下調(diào)，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3BⅡ)蛋白水平上調(diào)，細(xì)胞上清液中雙鏈DNA(dsDNA)濃度增加[38]。miR-15b-5p和miR-378a-3p通過靶向PDK1調(diào)節(jié)Akt/mTOR自噬途徑，誘導(dǎo)NETs形成，還可以作用于自噬激活劑高遷移率族蛋白B(HMGB)來誘導(dǎo)NETs形成。

5 總結(jié)和展望

膿毒癥發(fā)病機制復(fù)雜，尚無有效的診斷治療方法，預(yù)后很大程度上取決于早期識別和干預(yù)。而NETs成分MPO-DNA含量與膿毒癥序貫器官衰竭評分(SOFA)呈正相關(guān)，降解或減少膿毒癥NETs生成將成為研究熱點。Paula等[41]發(fā)現(xiàn)，早期且同時使用DNA酶和抗菌藥物治療，可以提高膿毒癥小鼠生存率，并減少重要臟器功能障礙的發(fā)生。因此，液體療法、抗菌藥物和NETs靶向藥物的聯(lián)合治療，可以優(yōu)化膿毒癥患者的治療效果，具有一定臨床應(yīng)用價值。

miRNA作為膿毒癥NETosis的有效調(diào)控因子，同時參與相關(guān)炎癥、自噬、凋亡等調(diào)控途徑。如果能通過靶向miRNA進而調(diào)控NETs生成減少，減輕膿毒癥患者器官功能損害，提高存活率且改善預(yù)后，將會為膿毒癥的治療提供新方向。目前已發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155可減少NETs介導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)肺損傷，miR-1696、miR-16-5p等也參與NETs的調(diào)節(jié)，但是否調(diào)控膿毒癥病理條件下NETs生成及其具體機制，仍需要進一步研究和驗證。