STAT3/IL-21通路介導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19參與大鼠重癥急性胰腺炎相關(guān)性腸損傷

葉 媛， 索質(zhì)君， 薛 芳

胰腺炎是由多種炎癥因子釋放引起的胰腺炎癥性疾病，其發(fā)病率存在一定地區(qū)差異，為(4.9～73.4)/10萬(wàn)，5%～10%患者伴有持續(xù)的器官功能障礙，進(jìn)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)[1]。對(duì)6970例器官功能障礙患者的系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析中，并發(fā)無(wú)菌性壞死病死率為19.8%，而并發(fā)感染性壞死病死率高達(dá)35.2%[2]。SAP早期常合并肺損傷、腸道損傷等單器官或多器官并發(fā)癥。腸道損傷早期表現(xiàn)為腸黏膜萎縮、腸道通透性增加，造成內(nèi)毒素和細(xì)菌移位、腸屏障功能障礙和繼發(fā)感染，炎癥介質(zhì)大量釋放，導(dǎo)致病死率升高。腸道損傷致腸屏障功能障礙與胰腺炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)[3-4]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)為非蛋白質(zhì)編碼RNA。有證據(jù)[5]表明，LncRNA參與基因表達(dá)調(diào)控和各種生物過(guò)程。其中，LncRNA H19可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]，參與各種炎癥性疾病的發(fā)展。多種LncRNA通過(guò)直接或間接地影響腸上皮細(xì)胞旁通透性、腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡，以調(diào)節(jié)腸屏障功能。已有研究[7]表明，STAT3信號(hào)通路參與SAP肺損傷的發(fā)生發(fā)展，白細(xì)胞中STAT3表達(dá)高低是胰腺炎嚴(yán)重程度的潛在預(yù)測(cè)因子，與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[8]。此通路是否參與SAP導(dǎo)致的腸屏障功能障礙的發(fā)病過(guò)程，仍需進(jìn)一步研究。

為確定H19及STAT3/IL-21信號(hào)通路是否參與SAP相關(guān)的腸道損傷的發(fā)生發(fā)展，本研究建立SAP大鼠模型，使用 STAT3 抑制劑進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-21(interleukin-21, IL-21)及淀粉酶的表達(dá)，并評(píng)估了腸道組織中腸屏障功能相關(guān)基因的表達(dá)，探討SAP相關(guān)性腸屏障功能障礙可能的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量220～260 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，合格證號(hào)：210726200100529986。研究樣本采集均經(jīng)過(guò)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：C202202-6)。

1.2主要試劑及儀器 主要試劑：牛磺膽酸鈉(阿拉丁)；STAT3抑制劑(STAT3-IN-1)(MCE)；大鼠血清淀粉酶酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特)；大鼠IL-21酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特)；Trizol試劑(Ambion)；引物由擎科生物合成。主要儀器：微型高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet公司)；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

1.3模型建立及實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠SAP模型建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d無(wú)異常后，隨機(jī)選擇45只大鼠分為對(duì)照組、SAP組和STAT3抑制組，每組15只。各組大鼠禁食16 h后，進(jìn)行造模：用10%水合氯醛按330 L/100 g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，上腹部正中開(kāi)口，找到十二指腸后，在十二指腸與胰腺之間找到胰管，用鑷子挑起后緩慢注射5%牛黃膽酸鈉，劑量0.1 mL/100 g，注射完成后歸位腸管，逐層縫合關(guān)腹，對(duì)照組注射等量生理鹽水。STAT3抑制組大鼠造模后腹腔注射STAT3抑制劑(STAT3-IN-1)，劑量10 mg/kg，其余兩組注射等體積0.5%DMSO。

1.3.2 標(biāo)本采集 造模后24 h，以10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血，靜置30 min后，3000 r/min離心10 min，收集上清液放置于-80 ℃冰箱凍存用于進(jìn)行后續(xù)生化檢測(cè)。取近盲腸部回腸，用于組織mRNA提取，放置-80 ℃冰箱凍存。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中淀粉酶及IL-21水平 大鼠血液樣本3000 r/min離心10 min，收集上清后，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠血清中淀粉酶及IL-21水平。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)大鼠血清中H19、STAT3以及腸道組織中咬合蛋白(Occludin)、帶狀閉合蛋白-1(ZO-1)、閉合蛋白(Claudins)-1、Claudin-2 mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取樣本RNA，按照兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR法擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)獲得(見(jiàn)表1)，由擎科生物公司合成。采用QPCR算法(2-ΔΔCt法)計(jì)算各目的基因mRNA表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列表

2 結(jié)果

2.1大鼠血清中淀粉酶與IL-21表達(dá) 采用5%牛磺膽酸鈉經(jīng)胰膽管逆行注射誘發(fā)SAP，該造模方法已廣泛應(yīng)用于研究胰腺炎的各種演變事件。與對(duì)照組比較，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清淀粉酶水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠造模成功。與對(duì)照組比較，SAP組及STAT3抑制組大鼠血清中IL-21水平明顯升高(P<0.01)；STAT3抑制組IL-21水平較SAP組下降(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組間血清中淀粉酶和IL-21表達(dá)比較

2.2大鼠血清中H19、STAT3 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中H19、STAT3基因mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；STAT3抑制組H19、STAT3基因mRNA表達(dá)較SAP組明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組間血清中H19、STAT3 mRNA表達(dá)比較

2.3大鼠腸道組織中ZO-1、Occludin、Claudins-1、Claudin-2表達(dá) 與對(duì)照組比較，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道組織中ZO-1、Occludin、Claudins-1基因mRNA表達(dá)水平明顯降低，而Claudin-2基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)。STAT3抑制組ZO-1、Occludin、Claudins-1基因mRNA表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，Claudin-2基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)，且三組間差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

表4 各組間腸道組織中ZO-1、Occludin、Claudins-1、Claudin-2表達(dá)水平

3 討論

SAP是一種高發(fā)病率、高入院率和高病死率的消化系統(tǒng)疾病。SAP患者體內(nèi)炎癥因子大量釋放，引起腸黏膜嚴(yán)重氧化應(yīng)激和caspase-3活化，導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響腸屏障功能[9]。在大鼠SAP早期，腸道免疫抑制導(dǎo)致細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，免疫屏障受損，進(jìn)一步加重腸屏障功能障礙[10]。腸黏膜損傷是 SAP 進(jìn)展的關(guān)鍵部分[11]，是多器官衰竭的始發(fā)事件。

腸黏膜機(jī)械屏障的最主要組成部分是緊密連接(tight junction，TJ)，廣泛分布于相鄰腸上皮細(xì)胞間，由多種跨膜蛋白(包括ZO、Occludin、Claudins)組成。許多疾病通過(guò)破壞TJ蛋白，導(dǎo)致腸黏膜上皮屏障功能障礙。為了進(jìn)一步證實(shí) SAP 發(fā)病期間腸屏障功能的變化，我們測(cè)定了跨膜蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道組織中ZO-1、Occludin、Claudins-1基因mRNA表達(dá)明顯降低，Claudin-2基因表達(dá)明顯升高，而STAT3抑制組較SAP組改善，表明當(dāng)大鼠發(fā)生SAP時(shí)腸屏障功能受損，而STAT3表達(dá)被抑制后腸屏障功能障礙有所減輕，提示STAT3信號(hào)通路可能參與SAP的發(fā)生發(fā)展。

SAP腸屏障功能障礙發(fā)生時(shí)，出現(xiàn)免疫失衡[12]。免疫平衡狀態(tài)受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，STAT3和IL-21在其中發(fā)揮重要作用。RNA序列分析顯示, STAT3對(duì)IL-21介導(dǎo)的基因調(diào)控至關(guān)重要，STAT3可直接與IL-21啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)IL-21基因的表達(dá)。有研究[13]表明，與中度急性胰腺炎(MAP)患者比較，SAP患者血漿中IL-21水平明顯升高，證明IL-21參與SAP“二次打擊”免疫失衡過(guò)程。也有文獻(xiàn)[14]提示，使用STAT3抑制劑導(dǎo)致Th17相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，IL-21水平明顯降低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)。SAP組大鼠IL-21水平較試驗(yàn)組明顯升高，而STAT3抑制組大鼠IL-21水平較SAP組有所下降。于是我們推測(cè)，SAP免疫抑制受STAT3/IL-21調(diào)節(jié)，并導(dǎo)致腸屏障功能障礙。

然而，SAP 中 STAT3/IL-21信號(hào)通路參與全身炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。眾所周知，STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)LncRNAs的轉(zhuǎn)錄活性。SAP 中STAT3/IL-21通路是否可介導(dǎo)LncRNAs表達(dá)變化，進(jìn)而減輕胰腺炎相關(guān)腸道損傷導(dǎo)致的炎癥瀑布仍需進(jìn)一步研究和探討。查閱文獻(xiàn)[15]發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19在維持腸屏障功能穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。H19是位于人類(lèi)染色體11p15.5上的印跡基因，其功能性產(chǎn)物是2.3 kb的保守LncRNA，主要在胚胎中表達(dá)，在出生時(shí)表達(dá)量下調(diào)，在腫瘤中明顯表達(dá)。H19與腸屏障功能相關(guān)研究主要集中在炎癥性腸病及腫瘤方面。研究[16]表明，H19可以調(diào)節(jié)腸易激綜合征患者腸道屏障中AQP1和AQP3的表達(dá)，進(jìn)而影響腸道屏障功能。H19過(guò)表達(dá)增加miR-675p豐度，降低ZO-1和E-cad mRNA水平，從而破壞上皮屏障的完整性[17]。急性腸缺血時(shí)，H19作為通過(guò)海綿miR-874調(diào)節(jié)AQP3表達(dá)的ceRNA起作用，改變腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和TJ蛋白的水平，促進(jìn)細(xì)胞旁通透性，影響腸屏障功能[18]。

本研究認(rèn)為，在腸功能障礙發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，H19扮演極其重要的角色，我們推測(cè)，STAT3/IL-21信號(hào)途徑介導(dǎo)H19上調(diào)參與SAP腸屏障功能障礙的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，使用STAT3抑制劑干預(yù)后，H19基因的mRNA表達(dá)明顯降低，腸屏障功能相關(guān)基因的表達(dá)明顯降低。下一步將進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證H19與STAT3/IL-21信號(hào)通路之間的相關(guān)作用機(jī)制。

綜上所述，STAT3/IL-21通路介導(dǎo)LncRNA H19上調(diào)，進(jìn)而下調(diào)ZO-1、Occludin、Claudins-1基因mRNA表達(dá)，增加Claudins-2基因mRNA表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致SAP大鼠腸屏障功能障礙加重。因此，STAT3/IL-21/H19通路可能作為SAP患者的潛在治療靶點(diǎn)。