益氣活血通絡方對糖尿病腎病大鼠腎組織RAGE/NOX4/ROS信號通路及氧化應激的影響

強家維， 靳賀超， 梁勝然， 張冠文， 呂哲， 郭登洲,*

(1.河北中醫(yī)學院 研究生學院， 河北 石家莊 050000； 2.河北中醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院 腎二科， 河北 石家莊 050000)

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會糖尿病地圖集第9版[1]的數(shù)據(jù)，全世界已有近10億人罹患糖尿病，預計到2030年患者人數(shù)占比將增加25%，到2045年，預計將增加51%。作為糖尿病患者最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)的發(fā)病率也在逐年上升。DKD的病理特征是腎小球系膜細胞擴張、基底膜增厚、細胞外基質(zhì)積聚，繼而出現(xiàn)腎小球硬化和腎功能下降,嚴重威脅人體的代謝功能和身體健康。該病生理病理機制復雜，已成為我國導致終末期腎病最重要的單一因素[2]。影響DKD進展的因素眾多，如高血糖、氧化應激、脂代謝紊亂和晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)等都會推動DKD的發(fā)生及發(fā)展。其中，高糖下的氧化應激是導致DKD進展的關鍵因素，過度的氧化應激會促進DKD的發(fā)展[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，由當歸、黃芪組成的當歸補血湯可通過改善線粒體功能障礙減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[4]。有研究表明煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)同樣是ROS的重要來源[5]，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)/NOX4通路[6]能夠?qū)OS產(chǎn)生影響，干預氧化應激狀態(tài)，存在減輕DKD大鼠腎損傷的可能機制。

本課題組以中醫(yī)相關理論為基礎并結合多年臨床實踐，認為瘀血阻絡證是貫穿DKD病程的重要病機[4]。采用益氣活血、化瘀通絡的治法是治療DKD的關鍵所在，益氣活血通絡方由益氣活血經(jīng)典名方當歸補血湯化裁而來，選用中藥黃芪、當歸、丹參、地龍。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用益氣活血中藥治療DKD模型大鼠的療效明顯[7]，相關實驗證實益氣活血通絡方可降低DKD大鼠腎組織中ROS的表達，緩解氧化應激，起到明顯的腎臟保護及延緩病程進展作用[8]。在前期研究基礎上，本研究通過觀察益氣活血通絡方對DKD大鼠腎組織病理、RAGE/NOX4/ROS通路在腎組織中表達的影響，探究該方通過調(diào)控RAGE/NOX4/ROS信號通路而減輕DKD大鼠氧化應激的可能性。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

1.1.1 動物

選取清潔級 SD 大鼠(雄性)40只，日齡：42～48 d，體質(zhì)量：(200±20)g。實驗大鼠由北京維通利華公司提供，實驗動物生產(chǎn)及使用許可證號：SCXK(京)2016-0006，質(zhì)量合格證號：110011200106395282。動物飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度22～25 ℃，濕度50%～70%。河北中醫(yī)學院動物倫理委員會批準編號：DWLL2019018。普通飼料及高脂高糖飼料均由南京盛民科研動物中心提供，編號HD001。造模組大鼠通過為期6周的高糖高脂飼料飼養(yǎng)，聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg·kg-1建立DKD大鼠模型，干預20周后禁食不禁水12 h，使用戊巴比妥鈉45 mg·kg-1麻醉，股動脈取血，采集標本。

1.1.2 藥物與試劑

每付益氣活血通絡方免煎顆粒由當歸3 g(批號0071093)、黃芪6 g(批號0061513)、丹參1.8 g(批號0070253)、地龍1 g(批號0057073)組成，廣東一方制藥有限公司配制。厄貝沙坦分散片，浙江華海藥業(yè)(75 mg/片，批號H20030016)；鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ,批號S0130)購自美國sigma公司；微量白蛋白(microalbumin,mALB)試劑盒(批號E038-1-1)，錳超氧化物歧化酶(supseroxide dismutase 2, SOD2)試劑盒(批號A001-2-1)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號A003-2-2)均購自南京建成生物工程研究所；DAPI染液(批號GDP1012)，HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(批號GB23303)，ROS染液(批號GDP1018)均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔來源一抗 RAGE(批號ET1702-27)、NOX4(批號ET1607-4)、SOD2(批號ET1701-54)均購自杭州華安生物技術有限公司；β-激動蛋白(β-actin)抗體(批號AC026)，購自武漢ABclonal公司。

1.1.3 儀器

病理切片機(RM2016)產(chǎn)自德國Leica公司；ONETOUCH型血糖儀產(chǎn)自美國強生LifeScan公司；光學顯微鏡(BX53)產(chǎn)自日本Olympus公司；熒光顯微鏡(BX43)產(chǎn)自日本Olympus公司；高速冷凍離心機(1-15K)產(chǎn)自美國sigma公司；半干轉(zhuǎn)膜儀(Semi-Day)產(chǎn)自美國Bio-Rad公司；電泳儀(DYCZ-40K)產(chǎn)自北京六一儀器廠；酶標儀(Infinite 200)產(chǎn)自瑞士Tecan公司； Clinx ChemiScope熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)產(chǎn)自上海Clinx公司。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制備、分組及給藥

普通飼料適應性喂養(yǎng)40只SD大鼠，7 d后檢測尿蛋白及血糖，結果均為陰性。按隨機數(shù)字表法選取正常對照組(CON)大鼠7只，予普通類型飼料喂養(yǎng)；供給其余大鼠高糖高脂飼料，為期6周，之后保證12 h內(nèi)禁食不禁水，將STZ溶于檸檬酸鈉緩沖液中配制成濃度為0.1 mmol·L-1的溶液，每kg大鼠體質(zhì)量注射35 mg溶液，將溶液一次性注射進大鼠腹腔，同時等量檸檬酸鈉緩沖液注射給CON組大鼠。72 h后大鼠尾靜脈取血查隨機血糖，1次/d，3次濃度均大于等于16.7 mmol·L-1時，為成功制備Ⅱ型糖尿病模型[9]。2只大鼠血糖低于標準予以剔除，2只大鼠腹腔注射STZ溶液72 h內(nèi)死亡。將29只Ⅱ型糖尿病模型大鼠隨機分為模型組(MOD)8只、益氣活血通絡方低劑量組(DL)7只、益氣活血通絡方高劑量組(DH)7只、厄貝沙坦組(IRB)7只。藥物灌胃量按照人與大鼠藥物劑量折算公式[10]計算，益氣活血通絡方低劑量組為每kg大鼠體質(zhì)量灌胃1.09 g藥物溶液，益氣活血通絡方高劑量組為每kg大鼠體質(zhì)量灌胃2.18 g藥物溶液，厄貝沙坦組為每kg大鼠體質(zhì)量灌胃0.017 g厄貝沙坦，給藥組大鼠灌胃給藥，頻率為1次/d，其余兩組大鼠用等量生理鹽水灌胃，給藥周期為20周，20周內(nèi)每周檢測體質(zhì)量，每4周檢測一次尿微量白蛋白(U-mALB)。

1.2.2 全自動生化分析儀分析UACR值、TBA法檢測血清MDA濃度及羥胺法檢測SOD2活性

給藥結束后，收集大鼠隨機尿，全自動生化分析儀檢測U-mALB含量及尿肌酐含量，計算其比值即為UACR值，該指標對于診斷早期腎損傷具有重要意義。大鼠麻醉后，股動脈取血，離心機分離上清取樣，采用TBA法檢測MDA濃度，羥胺法檢測SOD2活性。

1.2.3 HE染色法、Masson染色法、PAS染色觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)變化

大鼠麻醉取出腎臟后，左腎沿縱軸切開，取腎皮質(zhì)用4%多聚甲醛固定48 h，脫水透明后石蠟包埋、切片，分別進行HE染色、Masson染色、PAS染色，通過光學顯微鏡觀察腎組織病理變化，并采集圖像。

1.2.4 熒光探針標記法檢測大鼠腎組織ROS表達水平

在大鼠腎組織常規(guī)制備成的石蠟切片上滴加ROS染液，在室溫下避光浸入10 μmol/L二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)溶液孵育30 min，滴加DAPI染色液以染核，PBS液洗滌3次后，滴加適量抗熒光淬滅劑后封片，在熒光顯微鏡下觀察腎組織中紅色熒光情況，其熒光強度可反映ROS在不同組大鼠中表達量的變化。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件對所得圖片進行半定量分析，檢測結果為IOD值與面積的比值。

1.2.5 IHC法檢測大鼠腎組織RAGE、NOX4蛋白表達水平

取大鼠腎組織石蠟切片，在放入3%雙氧水溶液前先進行抗原修復，加入血清封閉， 滴加PBS稀釋好的RAGE一抗(VRAGE∶VPBS=1∶200)、NOX4一抗(VNOX4∶VPBS=1∶200)，4 ℃孵育過夜后，加入HRP標記的二抗， DBA顯色，并復染，然后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析免疫組化圖片。

1.2.6 Real-time PCR法檢測大鼠腎組織NOX4mRNA表達水平

研磨適量腎組織，遵照試劑盒說明書操作提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，使用一步法完成逆轉(zhuǎn)錄，引物由中實(天津)檢驗檢測有限公司合成，引物序列NOX4上游引物5’-CATCGATCTCTCTCGTGGGC-3’，下游引物5’-CGTACACGTAGTCCCACTCG-3’，長度234 bp；β-actin上游引物5’-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3’，下游引物5’-AGGGTCAGGATGCCTCTCTT-3’，長度為262 bp。據(jù)說明書完成引物擴增。反應條件為95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃ 退火20 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算出結果，即目的基因表達的相對量。

1.2.7 Western blot法檢測大鼠腎組織SOD2、RAGE、NOX4蛋白表達水平

取適量各組大鼠腎組織，每20 mg腎組織加入150 μL RIPA裂解液，經(jīng)過勻漿、裂解后，離心機離心取上清液，據(jù)BCA試劑盒內(nèi)置說明書測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，再通過轉(zhuǎn)膜液進行PDVF膜轉(zhuǎn)膜，置入裝有脫脂牛奶的孵育盒常溫封閉，使用適當濃度的一抗SOD2(VSOD2∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、RAGE(VRAGE∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、NOX4(VNOX4∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、β-actin(Vβ-actin∶V抗體稀釋液=1∶1 000)孵育過夜，回收一抗并以每次5 min時長為準用TBST洗3次，加入二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶5 000)，室溫孵育30 min，加入ECL試劑顯影。利用Image J軟件定量分析相應條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠的一般特征

CON組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色光澤順滑，行動敏捷，日攝食量、飲水量、排尿量及活動量均正常，體質(zhì)量增長符合周齡。MOD組大鼠表現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳，皮毛發(fā)黃發(fā)暗并見脫毛現(xiàn)象，部分大鼠眼球渾濁，行動遲緩，活動量減少，日攝食量、飲水量及尿量均出現(xiàn)明顯增多，并伴有消瘦、體質(zhì)量減輕。與MOD組比較，各治療組大鼠均有不同程度地好轉(zhuǎn)，提示益氣活血通絡方及厄貝沙坦對DKD大鼠臨床癥狀有改善作用。

2.2 對DKD大鼠UACR、SOD2、MDA的影響

與CON組比較，MOD組大鼠UACR值、MDA濃度均顯著升高， SOD2活性顯著降低(P<0.01)；與MOD組比較，IRB組及DH組SOD2活性明顯升高，UACR值、MDA濃度明顯降低(P<0.05，P<0.01)；DL組差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

1)P<0.05；2)P<0.01

2.3 對DKD大鼠腎組織病理學影響

與CON組比較，MOD組大鼠有以下病理表現(xiàn)：HE染色顯示腎小管基底膜增厚，Masson染色顯示腎小球肥大，系膜基質(zhì)增多明顯，系膜增生明顯，PAS染色顯示腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)顯著增多，有K-W結節(jié)；與MOD組比較，除CON組大鼠外其余各組腎組織病理及均有不同程度改善，其中DH組改善程度最明顯，優(yōu)于DL組、IRB組，DL組改善程度最差。見圖2-4。

圖2 各組DKD大鼠腎組織的HE染色結果(×400)

圖3 各組DKD大鼠腎組織的MASSON染色結果(×400)

2.4 對DKD大鼠腎組織ROS表達的影響

如圖5，與CON組比較，MOD組大鼠腎組織中紅色熒光表達明顯增多(P<0.01)，提示腎組織中ROS表達明顯增多，氧化應激程度最明顯；與MOD組比較，DL組、DH組、IRB組ROS表達均有不同程度減少，其中DH組減少有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 對DKD大鼠腎組織NOX4、RAGE蛋白定位表達的影響

與CON組比較，MOD組大鼠腎組織RAGE、NOX4蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與MOD組比較， DL組、DH組、IRB組大鼠RAGE、NOX4蛋白表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖6。

1)P<0.05; 2)P<0.01

2.6 對DKD大鼠腎組織NOX4 mRNA表達的影響

與CON組比較，MOD組大鼠腎組織NOX4mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與MOD組比較，IRB組大鼠及DH組NOX4mRNA表達均有降低(P<0.05)，DL組與MOD組的差異無統(tǒng)計學意義。見圖7。

1)P<0.05; 2)P<0.01

2.7 對DKD大鼠腎組織SOD2、RAGE、NOX4蛋白表達的影響

與CON組比較，MOD組大鼠腎組織RAGE、NOX4蛋白表達顯著升高，SOD2水平顯著降低(P<0.01)；與MOD組比較，各給藥組SOD2蛋白表達明顯升高，IRB組及DH組大鼠RAGE，NOX4表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖8。

圖8 各組DKD大鼠腎組織中SOD2、RAGE、NOX4蛋白表達

3 討論

目前對于DKD的治療手段相對局限，現(xiàn)代醫(yī)學主要治療方法為降血糖和降血壓，但這難以改變DKD發(fā)展為終末期腎病乃至死亡的結局，DKD以及其他并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率仍然很高[11]，大多數(shù)患者會進展為終末期腎病，需要終生透析或腎移植[12]。在DKD諸多病理機制中，氧化應激近年來獲得學術界越來越多的關注，同時它也是促進DKD發(fā)生發(fā)展的不容忽視的推動劑。中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療DKD的相關研究不斷涌現(xiàn)，為該病的治療提供了新思路，相關成果顯示中醫(yī)藥在DKD防治方面有獨特優(yōu)勢[13-14]。

糖尿病腎病屬中醫(yī)文獻中記載的“腎消”及其消渴病繼發(fā)的“水腫”“尿濁”等范疇?！妒備洝吩? “消腎，小便白濁如凝脂，形體羸瘦?！薄峨s病源流犀燭》中指出“有消渴后身腫者，有消渴面目膝腫小便少者。” 本病早期中醫(yī)病機是陰虛燥熱，日久陰傷氣耗，導致氣陰兩虛，繼而陰損及陽，進展至陰陽兩虛，最終發(fā)展到氣血陰陽俱虛這一證候；因本病多遷延難愈，久病多虛，氣無血不載，血無氣不行，氣虛則無力推動血行以成瘀血，瘀血阻絡證貫穿DKD病程始終。因此益氣活血、化瘀通絡是治療DKD的關鍵。益氣活血通絡方中黃芪補氣固表為君，且黃芪3倍于當歸，意在補氣，且能生血、行血，當歸補血活血為臣，二藥主以益氣活血；方中又佐丹參活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡，全方共奏益氣活血、化瘀通絡之功效。其中黃芪中所含有效成分黃芪甲苷等，在抗氧化應激、抑制足細胞凋亡、延緩DKD發(fā)展方面作用突出[15-16]；當歸中阿魏酸等有效成分，藥理作用有抗氧化，保護腎組織[17]。本課題組前期研究證實當歸、黃芪配伍可通過抗氧化應激、減少24 h尿蛋白、抑制系膜細胞增殖等作用改善 DKD癥狀[4，7]。吳芳等[18]通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，丹參可通過減輕氧化應激反應等過程保護腎小球、減輕腎損傷。關于地龍的藥理研究發(fā)現(xiàn)，地龍抗氧化提取物在體外具有較強的清除ROS的作用，可以升高成年小鼠血液中SOD活性且降低MDA濃度，降低小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平并且防止體內(nèi)抗氧化酶受ROS誘導的氧化應激損傷[19]。本研究結果顯示造模組大鼠尿蛋白升高，腎小球肥大，系膜增生，基底膜增厚，可見K-W結節(jié)，腎小管上皮細胞泡沫樣變，符合DKD大鼠模型標準，造模成功。DH組和IRB組分別經(jīng)益氣活血通絡方和厄貝沙坦干預后，蛋白尿及腎組織病理明顯改善，其中DH組略優(yōu)于IRB組，提示益氣活血通絡方和厄貝沙坦對DKD大鼠具有腎保護作用，益氣活血通絡方高劑量療效略好于厄貝沙坦。 DL組與MOD組比較，UACR值差異無統(tǒng)計學意義，說明該方在治療DKD過程中劑量同樣是影響療效的重要因素。

在DKD的起始因素高血糖的誘導下[20]，AGEs和RAGE的生成增加，RAGE作為AGEs關鍵結合蛋白之一[21]，在腎臟中廣泛存在，在腎小球系膜細胞、足細胞、腎小管上皮細胞中均有表達[22]，其在AGEs介導的信號轉(zhuǎn)導以及激活ROS相關因子中具有重要作用[24]。AGEs-RAGE的過度活動能夠直接推動DKD的發(fā)生發(fā)展進程[23]。連接AGEs/RAGE軸及其下游的轉(zhuǎn)運體是NADPH氧化酶中的NOX酶，AGEs/RAGE相互作用可以激活NADPH氧化酶，使其活性顯著升高[25]。NADPH酶途徑是產(chǎn)生ROS的主要途徑之一，NADPH氧化酶有7種亞型，NOX1-5和雙氧化酶(DUOX)1和2，NOX酶的生物學功能是通過在生物膜上傳遞電子來產(chǎn)生ROS，其中，NOX4是DKD腎組織中促進ROS生成增多的關鍵氧化酶，是腎臟中產(chǎn)生ROS的來源之一[26]，同時NOX4處于腎組織細胞RAGE下游的一條核心通路，與氧化應激密切相關[27]，經(jīng)由該通路激活下游通路并介導的損傷是DKD的關鍵病機。相關研究已經(jīng)證明，抑制NOX4對嚙齒類動物的腎臟損傷和糖尿病腎病有保護作用[28-29],基于DKD患者NOX活性增加和ROS生成增多的證據(jù)，NOX4等已被探索為潛在的治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)，雙特異性NOX1/NOX4抑制劑GKT137831可成功地改善糖尿病小鼠模型的腎小球結構改變、蛋白尿和纖維化信號[30-31]。在腎小球系膜細胞對血管緊張素Ⅱ的反應中，NOX4的上調(diào)被證明與肥大和纖維連接蛋白的堆積有關[32]，并且NOX4參與介導了高糖反應中足細胞ROS生成增多的過程[33]。NOX4衍生的ROS是糖尿病腎病腎臟形態(tài)改變和功能異常的主要因素。許多糖尿病動物模型證明ROS是糖尿病腎病的重要決定因素[34-35]。正常機體會產(chǎn)生少量ROS，其具有保護細胞并維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，但在高糖或AGEs、RAGE等誘導下NOX4氧化酶被激活，會導致腎臟ROS生成增多，機體自身的抗氧化酶等構成的抗氧化防御系統(tǒng)難以負荷，增多的ROS會導致包括蛋白質(zhì)和DNA在內(nèi)的細胞成分受到損傷，系膜細胞、足細胞和腎小管細胞發(fā)生纖維化反應[36]，最終引起腎小球纖維化和腎功能下降，而導致DKD的進展[37]。綜上，高糖誘導下 AGEs與系膜細胞和近端小管上皮細胞中的RAGE結合，激活該條通路，在NOX4作用下引起ROS增多，ROS 在細胞內(nèi)大量積累，加重氧化應激，導致腎組織損害[38]。本研究中，益氣活血通絡方降低了腎組織中RAGE、NOX4的表達，明顯減少了腎組織中ROS的表達，提示益氣活血通絡方可能通過RAGE/NOX4/ROS通路減輕了腎組織的損害。本研究為益氣活血通絡方治療糖尿病腎病提供了理論依據(jù)，中醫(yī)藥治療疾病特點為多渠道、多靶點，該復方中有效成分是否通過其他途徑減輕DKD腎損害有待進一步研究。

綜上，益氣活血通絡方可能通過降低RAGE、NOX4的表達，減少腎組織中ROS的表達，緩解氧化應激，降低高糖條件下DKD大鼠的尿蛋白和腎組織損害，起到明顯的防治腎臟損害的作用。

作者貢獻聲明

強家維：提出研究思路和框架，設計實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，參與動物實驗的具體實施，撰寫論文，修改論文；靳賀超：提出研究思路和框架，設計實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)；郭登洲：提供研究方向建議，提供論文修改建議；梁勝然、張冠文、呂哲：參與動物實驗的具體實施。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。